刘长召，吕瑾

(恩施土家族苗族自治州中心医院内科心血管病中心，湖北 恩施 445000)

蒽环类化合物阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前临床上常用的抗肿瘤化疗药物之一，被广泛应用于急性白血病、恶性淋巴瘤及实体瘤的临床治疗中。但DOX在用药后会出现一些不良反应，特别是剂量依赖的心脏毒性限制了其长期使用。由DOX诱发的心脏毒性通常可导致不可逆的心肌损伤，进而使患者发生充血性心力衰竭，甚至死亡[1,2]。DOX心肌病的发病机制复杂，涉及多种信号通路的异常改变及多种形式的心肌细胞死亡。如在DOX心肌病的发生过程中，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信号通路被异常激活，进而诱发心肌细胞凋亡[3]。DOX也可通过激活红系衍生的核因子2相关因子，介导血红素降解增多和心肌细胞线粒体铁过载，最终诱发心肌细胞铁死亡[4]。此外，最新的研究表明，NLR家族Pyrin域蛋白3[NO-like-binding domain (NOD)-like receptor protein 3，NLRP3]炎症小体激活介导的心肌细胞焦亡也是诱发小鼠DOX心肌病的重要机制之一[5]。因此，靶向抑制上述过程对减轻DOX心肌损伤具有重要意义。鲁斯可皂苷元(ruscogenin，Rus)是从植物麦冬中提取的一种重要的甾体皂苷元，具有多重药理作用。如Rus可通过阻断Toll样受体4激活，进而抑制脂多糖诱导的肺内皮细胞凋亡[6]。Rus还可通过抑制NLRP3炎症小体激活和p38MAPK通路来减轻脑缺血诱导的血脑屏障功能障碍[7,8]。但Rus是否可通过抑制NLRP3炎症小体激活和p38MAPK途径发挥抗DOX心肌损伤作用目前尚未见文献报道。本研究通过构建急性DOX心肌损伤的小鼠模型，观察并探究了Rus对小鼠心功能、心肌细胞凋亡的影响及潜在机制，旨在为今后DOX心肌疾病的预防及治疗提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一抗：Bax(货号：ab32503，1∶5 000)、Bcl-2(货号：ab182858，1∶1 000)、NLRP3(货号：ab263899，1∶1 000)、含有caspase募集结构域的凋亡相关斑点蛋白 (apoptotic speck protein containing a caspase recuitmant domain, ASC，货号：ab155970，1∶1000)、p38蛋白磷酸化(phosphorylated-p38，P-p38,货号：ab178867，1∶1 000)、总p38(total-p38货号：ab170099，1∶5 000)及GAPDH(货号：ab181602，1∶5 000)均购自于美国Abcam公司；二抗：羊抗兔IgG(批号：926-32211)购于美国LICOR公司；ruscogenin(目录号：HY-N0496)购自于上海Med Chem Express公司，纯度>98%。

1.2 实验动物及脓毒症心肌损伤模型的建立

本实验中所使用的实验动物为雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，体质量250～300 g，购自湖北省预防医学科学院动物中心。本实验所有操作获实验动物护理和使用委员会批准。根据随机数表法将32只小鼠随机分为空白对照组(Sham组)、Rus组、DOX组、DOX+Rus组，每组8只。DOX组和DOX+Rus组小鼠接受单次腹腔注射DOX(15 mg/kg)的方式构建急性DOX心脏毒性模型。Rus及DOX+Rus组小鼠于DOX注射当天开始，每天下午15∶00给予10 mg/kg的Rus灌胃处理，持续7 d。

1.3 多普勒超声评价小鼠心功能

4组小鼠通过吸入浓度为1.5%的异氟烷进行麻醉，使用剃毛器小心剔去小鼠心前区毛发，并将小鼠放置于恒温加热板。随后采用MyLab 30CV多普勒超声诊断仪器检测4组小鼠的心功能指标。在靠近乳头肌水平的胸骨旁长轴和胸骨旁短轴上以2D模式成像后，记录1个2D引导的穿过左心室前壁和后壁M型超声，随后收集并计算心脏的形态学参数，包括心率(heart rate，HR)、射血分数(ejection fraction，EF)、短轴缩短率(fraction shortening，FS)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)。上述参数最终取4个连续心动周期的平均值。

1.4 实时荧光定量PCR检测

首先，提取4组小鼠左心室组织样本中总RNA，具体步骤如下：在低温环境下，每个样本取20～30 mg心肌组织剪碎并研磨，提取总RNA。利用紫外分光光度计检测所获RNA的浓度及纯度。其次，进行Avian Myeloblastosis Virus(AMV)逆转录，具体步骤如下：取0.65 ml EP管，加入4.5 μl DEPC水，1.0 μl引物及1.0 μl模板RNA。离心并沸水浴后加入0.5 μl DNTP，2.0 μl 5 × Buffer及1.0 μl AMV逆转录酶，离心后进行逆转录获取cDNA。最后，对各样本进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测。将上述步骤中获取的cDNA加60.0 μl DEPC水稀释后，配置如下反应体系：正向引物及反向引物各0.5 μl；DEPC水，8.0 μl；SyBr Green 10.0 μl。最终以GAPDH作为内参基因进行校正。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used in qRT-PCR

1.5 血清乳酸脱氢酶水平检测

实验结束后，取4组小鼠眼眶血1 ml，4 ℃条件下以3 500 转/min离心5 min，分离血浆，取上层血清，采用血清乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)试剂盒，按试剂盒说明书操作，应用双抗体夹心法测定血清中LDH水平。

1.6 蛋白质印迹法检测

将4组小鼠心室肌组织在裂解缓冲液中充分研磨后进行超声裂解。充分裂解后，离心吸取上清，依次分装至预先准备好的EP管，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测量总蛋白浓度，并定容至各样本等浓度。分装后放入-80 ℃冰箱保存备用。将4组总蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用12%分离胶，5%浓缩胶，待电泳结束后，将凝胶中的蛋白转入醋酸纤维素膜中，分别用抗Bax、Bcl-2、NLRP3、ASC、T-p38和P-p38的一抗孵育过夜(4 ℃)，随后于二抗(羊抗兔 IgG)稀释液中避光孵育，置于摇床上50 min，利用Odyssey扫膜仪对蛋白条带扫描并进行定量分析。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 Rus对DOX所致心功能不全的保护作用

4组小鼠心率比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sham组及Rus组心功能各项指标EF、FS、LVEDD和LVESD比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；与Sham组相比，DOX组小鼠EF和FS明显降低，LVEDD和LVESD明显升高(均P<0.05)；但经Rus处理后，DOX小鼠的EF和FS明显升高，而LVEDD和LVESD则明显降低(均P<0.05，表2)。

2.2 Rus抑制DOX所致的心肌损伤

与Sham组小鼠相比，DOX组小鼠血清中LDH的含量明显增高(P<0.05)，但Rus干预可明显抑制DOX小鼠血清中LDH的水平(P<0.05，图1)。

2.3 Rus抑制DOX所致的心肌细胞凋亡

与Sham组相比，DOX组小鼠心肌组织中促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的比值明显增高(P<0.05)；相反，经Rus干预后，DOX心肌病小鼠心肌组织Bax和Bcl-2比值明显降低(P<0.05，图2A、B)。

2.4 Rus通过抑制NLRP3炎症小体激活改善小鼠DOX心肌病

DOX可使小鼠心肌组织中NLRP3和ASC的表达水平明显增加(均P<0.05，图3A～C)，Rus干预可明显降低NLRP3的表达水平(P<0.05)，但不影响ASC的表达水平(P>0.05，图3A～C)。qRT-PCR结果显示，DOX注射后，小鼠心肌组织中细胞焦亡标志物Caspase 1，IL-1β和IL-18的mRNA表达水平明显增加(均P<0.05)，Rus干预可明显抑制上述基因的mRNA表达(均P<0.05，图4A～C)。

表2 4组小鼠心功能指标比较

图1 4组小鼠血清中LDH的释放Figure 1 Release of LDH in serum in four groups LDH: lactic dehydrogenase; Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

2.5 Rus可通过抑制p38MAPK途径发挥心脏保护作用

Rus可明显抑制DOX所致的小鼠心肌细胞P-p38磷酸化水平增加(P<0.05，图5A、B)。

3 讨 论

本研究首先观察了Rus对DOX心肌病的保护作用，并进一步阐明了Rus抗DOX所致心脏毒性的潜在机制。DOX心肌病最常见的心功能不全表现为EF和FS下降，同时心脏结构也会出现一定程度的改变，表现为LVEDD和LVESD水平升高[9]。本研究结果显示，Rus可明显逆转DOX诱导的心脏结构改变和功能异常。Bax和Bcl-2共同隶属于Bcl-2基因家族。Bcl-2是细胞凋亡抑制基因，Bax不仅具有间接拮抗Bcl-2的抑凋亡作用，还可直接促进细胞凋亡[10]。DOX在进入心肌细胞后，可造成线粒体结构异常和功能障碍，导致大量促凋亡介质释放到胞浆中，启动凋亡级联反应，最终诱发细胞凋亡[11]。本研究中，Rus干预后DOX心肌病小鼠心室组织中Bax蛋白表达水平明显降低，而Bcl-2蛋白水平则明显升高，表明Rus可抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡。

图2 4组小鼠心肌细胞凋亡状况Figure 2 Levels of apoptosis-related proteins in four groups A: Western blotting; B: statistical analysis. Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; TUNEL: terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling. Compared with sham group,*P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

图3 4组小鼠心肌组织中NLRP3和ASC的表达Figure 3 Expression of NLRP3 and ASC in four groups Rus: ruscogenin; DOX: doxorubicin; NLRP3: NO-like binding domain-like receptor protein 3; ASC: apoptotic speck protein containing a caspase recruitment domain. Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

图4 4组小鼠心肌组织中IL-1β，IL-18 and caspase 1的基因表达Figure 4 Levels of inflammasome-related proteins in four groups Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; IL-1β: interleukin-1β; IL-18: interleukin-18. Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

图5 4组小鼠心肌组织p38MAPK信号通路的激活状况Figure 5 Activation of p38MAPK signaling pathway in four groups p38-MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase; Rus: ruscogenin; DOX: doxorubicin; P-p38: phosphorylated-p38; T-p38: total-p38. Compared with sham group,*P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

NLRP3在天然免疫调控中发挥重要的作用。完整的NLRP3炎症小体主要包括NLRP3，Caspase 1和ASC 3个成员[12]。DOX在进入心肌细胞后，可通过激活NLRP3炎症小体，招募并活化下游的Caspase 1，Caspase 1切割并激活IL-1β和IL-18，进而切割并活化Gasdermin蛋白，使之转位到膜上，形成孔洞，导致细胞肿胀破裂，发生细胞焦亡[5，12]。Caspase 1作为在哺乳动物中发现的第一种半胱天冬酶，可促进细胞焦亡的发生[13]。本研究中，发生DOX心肌病小鼠心肌细胞凋亡和焦亡水平均明显升高，但经Rus干预后，NLRP3的蛋白表达水平明显被抑制，心肌细胞焦亡随之被抑制。由此推测，抑制NLRP3蛋白表达可能是Rus抗心肌细胞凋亡和焦亡的主要机制之一。

p38MAPK信号通路对细胞各种应激反应的发生具有重要意义，也与各种心肌损伤的发生发展密切相关。抑制p38MAPK途径的激活是防治DOX心肌病的重要策略之一[14]。本研究发现，Rus干预可明显降低DOX心肌病小鼠心肌组织中p38蛋白的磷酸化，从而阻断p38MAPK途径。由此推测，Rus抗DOX心肌病的另一种机制可能与p38MAPK途径的抑制有关。

本研究首次证实了Rus可减轻小鼠DOX心脏毒性。Rus可能通过同时抑制NLRP3小体激活和p38MAPK通路的激活，进而抑制小鼠心肌细胞凋亡，最终改善小鼠心脏功能。但仍需要进一步实验研究探讨Rus精确的分子靶点。