刘波 王瑛，2 韩欣，2 詹国平 薛晓晶*

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100123；2.中国农业大学）

1 前言

据世界贸易组织（WTO）秘书处初步统计，2013年中国已成为世界第一货物贸易大国，进出口总额首次突破4万亿美元大关，高达4.16万亿美元，进出境人员4.54亿人次、交通运输工具2 559.96万辆（架、列、艘）次。近年来，随着对外经济贸易的不断发展，新兴业态不断涌现，国门生物安全形势日益严峻。通过交通运输工具、旅游者、海洋垃圾等途径，由新发病原或变异毒株引起的传染病、人畜共患病及有害生物，呈跨境传播及蔓延态势，国门生物安全受到社会各界的广泛关注。据统计，由气溶胶传播的病原微生物高达数百种，因此，针对口岸微生物气溶胶的监测检测是保障国门安全的重要环节，是维护国门生物安全的第一道防线。

2 微生物气溶胶概况

2.1 气溶胶的概念

气溶胶是悬浮在气体介质中的固态或液态颗粒所组成的气态分散系统。这些固态或液态颗粒的密度与气体介质的密度可以相差微小，也可以十分悬殊。颗粒大小一般为0.001～100μm，形状各异，可以是近乎球形如液态雾珠，也可以是片状、针状及其它不规则形状。从流体力学角度，气溶胶实质上是以气态为连续相，固、液态为分散相的多相流体。气溶胶分为烟、雾和灰尘，可自然产生或人工合成。

微生物广泛存在于自然界中，各种微生物微粒如细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体等，悬浮于气体介质中形成的分散体系称之为微生物气溶胶。微生物气溶胶依其种类可划分为细菌气溶胶、真菌气溶胶、病毒气溶胶等。病原微生物气溶胶的存在可引起环境污染及气源性传染病的暴发流行，影响人类健康，危害公共安全[1]。

2.2 微生物气溶胶的研究概况

空气中的微生物大多依附灰尘等气溶胶粒子而构成微生物气溶胶，其具有来源复杂、种类多样、活性易变、播散范围大和感染广泛等特性[2]。微生物气溶胶从形成的瞬间开始就处于一直变化的状态，影响微生物气溶胶衰减和总量的因素很多，主要有：微生物的种类、气溶胶化前的悬浮机制以及各种环境因素。

空气中的微生物数目、菌谱等是评价环境空气质量及其危害人体健康程度的重要指标。世界上约有500多种致病菌，经气溶胶传播的至少有100多种，占全部传播途径的首位[3]。大气微生物的研究可以追溯到17世纪，20世纪以来，美国、法国、英国、日本、印度等国都开展了相应的研究。Shale K研究了屠宰场气溶胶中金黄色葡萄球菌的浓度，发现气溶胶中金黄色葡萄球菌的浓度与肉品负载金黄色葡萄球菌的数量呈正相关[4]。Zayas的研究表明，人咳嗽时产生的气溶胶颗粒是呼吸道传染病的传播途径中，人与人传染的基本途径[5]。牙科医生治疗和处理过程中产生的气溶胶，被认为是传染性疾病潜在感染途径[6]。Flores等研究了室内生物气溶胶浓度对人体健康的影响，高细菌浓度的气溶胶会引起呼吸道不适、头痛等症状[7]。

近年来，我国科研人员也对空气中微生物的污染进行了大量的研究。北京、天津、兰州、西安、石河子等地都有微生物气溶胶研究的报道[8-10]。目前，国内对微生物气溶胶的研究多为调查研究，即在一定时间内对室内或室外场所的空气微生物气溶胶进行采样，了解微生物的浓度、种属等情况，并分析分布特征和潜在来源。研究中主要采用的检测指标包括菌落总数、细菌总数、真菌总数，以及有针对性的病原菌、条件致病菌及微生物耐药情况等。

随着社会各界对生物安全风险防控意识的不断增强及现代科学技术的飞速发展，微生物气溶胶的科学研究愈发广泛，研究内容覆盖工农林牧渔、环境、气候、医学等各个学科领域。微生物气溶胶的研究也从单靶标定向检测向多靶同检发展；检测试剂由散装式技术向模块化封装式技术转移；在风险评估方面正在从定性化到量化分析技术转移；控制技术由传统的污染型向高效、广谱、低腐蚀、无污染的控制技术发展。

3 微生物气溶胶研究方法

微生物气溶胶研究方法主要包括微生物气溶胶的采样方法和检测鉴定方法2类。

3.1 微生物气溶胶采样方法

空气中微生物气溶胶的含量是空气环境污染的重要参数之一。根据微生物气溶胶的特殊存在形式及粒径分布，选择适合的采集方法至关重要。目前采集方法大多包含以下步骤：先将空气微生物气溶胶的微生物分散相和空气连续相分离，再将采集到的微生物颗粒或微生物附着颗粒稳定保存，以供检测或培养。采集方法依原理主要包括被动沉降类、动力分离类和其它类3种[11]。

3.1.1 被动沉降类采样方法

3.1.1.1 自然沉降法

自然沉降法是空气中微生物气溶胶采集最常用的方法之一，是由德国细菌学家Koch于1881年建立的依靠空气微生物粒子的重力，在一定时间内让所处区域空气中的微生物颗粒逐步沉降到带有培养介质的平皿内的一种采样方法。该方法所需设备低廉、操作和评价要求简单，曾在世界范围内被广泛使用，但容易受到外界气流的影响，不能测定空气流量和悬浮小粒子上的细菌[12]。

3.1.1.2 沉降式静电采样法

沉降式静电采样法主要通过带有电荷的纤维布或其他导体来收集空气中的带电生物气溶胶颗粒，可以最大程度保持微生物的活性。其代表是国外设计的一种静电沉降收集器，主要由静电布组成，用于收集农场空气中的毒素。研究发现，沉降式静电采样法可以有效收集到空气内毒素，但只能被动采集到静电导体周边小范围内的带电颗粒，不能完全代表实际空气中的生物气溶胶浓度。

3.1.2 动力分离类方法

动力分离类方法是先通过便携泵给空气提供动力，再分离空气中微生物的一种技术。目前在泵的稳定性、电池续航能力、空气动力学设计等方面均有较大发展。根据采样器结构又分为裂隙式、离心撞击式、过滤式和静电采样法。

3.1.2.1 裂隙式采样法

裂隙式采样法是利用抽气装置，以每分钟恒定气流量使空气通过狭小喷嘴，使空气和悬浮于其中的微生物粒子形成高速气流，在离开喷嘴时气流射向采集面，气体沿采集面拐弯而去，而颗粒则按惯性继续直线前进，撞击并粘附于采集面上，从而被捕获。按撞击面不同又分为固体撞击式和液体撞击式。是当今应用最广泛的采集方法，可作空气微生物的定量测定。

3.1.2.2 离心撞击式采样法

离心撞击式采样器是利用气体在旋转径路中运动时所产生的离心力，使粒子获得一定动量，并因其惯性而偏离气体流线，撞击沉着在附近的采集面上。

3.1.2.3 过滤式采样法

过滤式采样法利用抽气装置使空气通过滤材而使微生物粒子阻留在滤材上。滤膜是该技术的核心，根据滤膜的孔径和材质决定其用途。过滤式采样法的捕获率较高，对环境温度无太多要求；但该方法不适用于不耐干的微生物，因为阻塞导致的气流量不稳定和采样膜的二次处理可能会降低采集效率。

3.1.2.4 静电采样法

研究发现，气化的细菌带有自然电荷，其带电量大小不等。虽然在外界环境中，生物气溶胶的带电电荷量一部分被大气粒子所中和，但依据静电吸附原理还是可以采集到带有自然电荷的生物气溶胶。

3.1.3 其它采样法

温差迫降采样法是基于粒子的热泳原理，使空气中微生物粒子沉着于采集面上的一种采集方法，其采样设备复杂，应用较少。

生物类采样法即利用敏感的动物和植物来进行空气微生物的检测，如Constantine用草原狼、狐狸、田鼠检测洞穴空气中的狂犬病毒。此类方法由于动物的管理等原因除特殊情况外应用较少。

3.2 微生物气溶胶的检测鉴定方法

目前可以用于微生物气溶胶检测的方法有很多，如微生物培养计数法、直接镜检法、生物传感器技术、基因芯片技术、PCR法等，这些检测方法的建立推动了微生物气溶胶的研究发展及应用。

3.2.1 微生物培养计数

微生物培养计数和显微镜计数法是比较传统的微生物气溶胶检测方法，主要用于微生物气溶胶中微生物的定性检测与计数，目前国内大多应用此法进行气溶胶微生物检测。魏磊等利用此法在不同季节对鸡舍环境中气载需氧细菌及气载葡萄球菌的含量变化进行了分析，但是此法费时费力，且只能用于研究气溶胶中的可培养微生物，对气溶胶中的不可培养微生物则无法检测[13]。据报道，空气中可培养微生物在10%以下，并且部分微生物培养时间较长或培养条件较为苛刻（如病毒），因此微生物培养计数法存在较大的局限性。

3.2.2 显微镜计数法

显微镜计数法或称染色计数法，是通过将微生物DNA用特定染料进行染色后，借助显微镜进行观察的一种微生物检测方法。4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色法已被认为是一种标准的测定浮游微生物总量的方法。刘敬博等分别采用直接培养法和DAPI染色法测定了畜禽养殖场鸡舍和猪舍环境内微生物气溶胶的浓度，发现通过培养计数法所测得的鸡舍浓度仅占DAPI计数法的1.63%～2.34%，猪舍培养出微生物浓度占DAPI染色计数法的1.93%[14]。表明通过染色后的直接荧光镜检计数检测结果比培养计数法的准确性更高，不仅可以检测空气中活的微生物，还可以检测死细胞，是一种比较快捷简便的空气微生物检测方法。

3.2.3 生物传感器

生物传感器是以生物学组件为主要功能性元件，将特定的生物质浓度转换为电信号，并对其进行检测的仪器。目前，生物传感器以识别元件的差异进行分类，可分为酶传感器、免疫传感器、微生物传感器和组织传感器、细胞传感器、DNA生物传感器等。美国在2000年就已经报道研制出了可检测肉毒杆菌等病原体的生物传感器，而Song等也制备出能够检测霍乱病菌的生物传感器[15]。生物传感器在较复杂的体系中能够进行快速连续监测，且具有高选择性、高灵敏度、低成本等优点，可以用于检测具有多个信号识别位点的病原体。因此生物传感器已成为最具潜力的微生物检测技术之一，并可应用于病原微生物气溶胶的检测中。生物传感器法可对气溶胶微生物进行快速检测，因此在某些紧急情况下具有非常重要的意义。

3.2.4 基因芯片技术

基因芯片技术是采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针分子固定于支持物表面，然后与标记样品杂交，通过对探针分子杂交信号的检测，进而获取样品分子的基因序列信息。基因芯片技术可实现对样品的高通量检测，所需检测时间短，特异性强。近年来基因芯片技术已成功应用于微生物如细菌、病毒、真菌的一些重要基因筛选检测、菌种鉴定研究等。曹三杰等构建了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片，可同时检测家禽的几种主要气源性疫病病原体新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV），其检测灵敏性好，特异性高，检测结果也与RT-PCR方法基本一致[16]。李永强等以黄病毒属的日本脑炎病毒（JBEV）作为检测敏感性的模型，结合PCR技术，对基因芯片的敏感性进行了测定。发现人兽共患病病毒基因芯片至少可以检测出300 ng的随机PCR产物核酸量，对病毒的检测敏感性与特异PCR检测敏感性相当。表明该人兽共患病病毒芯片技术达到了较高的检测敏感性，利用基因芯片技术检测病毒性病原体是可行的[17]。

3.2.5 PCR技术

PCR技术对病原微生物气溶胶的检测，是通过采样器采集空气的微生物样品，再经过DNA或RNA提取、PCR扩增和凝胶电泳图谱分析等达到检测微生物的目的。Fallschissel等通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）来检测禽舍空气中的沙门氏菌，结果表明用qPCR检测沙门氏菌属气溶胶的可行性[18]。徐潜等分别用RT-PCR和病毒分离培养方法对空气样中SARS病毒进行了检测[19]。刘凡等利用巢式PCR对广东省四家医院空气微生物气溶胶进行了研究，表明利用PCR技术对空气微生物气溶胶进行检测可行[20]。PCR方法由于特异性强、操作简便，可检测细菌和病毒的DNA，通过反转录PCR也可检测RNA病毒，荧光定量PCR还可以实现对DNA或RNA的绝对定量分析，因此近几年在空气微生物气溶胶的研究中使用越来越多，在微生物气溶胶检测方面具有良好的应用前景。

3.2.6 微全分析技术

微全分析即微缩芯片实验室，需要集成光机电、材料、生物，纳米等多种学科，是一项高新综合技术，因其具有微型便携与集成自动等优点，早期被寄予厚望。同时，微全分析技术也存在着一些瓶颈性难题，如难以把样品处理与检测分析集成在一起，难以建立稳定高效的芯片制作工艺，难以实现大体积样品分析等。目前，微全分析技术的先进国家为美国，中国检科院基于塑料微流体芯片集成微泵（阀）实现微流体智能化操控，建立了微流体芯片精密注塑批量生产工艺，开发了便携式和台式微流体控制系统，建立了动物疫病、植物病毒、人传染病等微全分析方法。该技术有潜力做到现场、原位、实时、高通量地检测与监测，可满足基孔肯雅热病、猪链球菌等病原检疫监测迫切需求。

4 微生物气溶胶监测检测仪器

4.1 微生物气溶胶采样器

空气微生物气溶胶采样器是开展空气微生物研究和监测的必要工具，针对不同的采样方法进行设计，国内外现有的采样器种类、型号繁多，微生物气溶胶采样时需要考虑研究对象及研究目的和内容，以确定采集方法及适用的采集器。

Andersen采样器是最具代表性的固体撞击式采样器，不仅能测定空气中活性粒子数量，而且能测定大小，对病毒有很好的采集作用，是被国际承认的检测空气微生物生物粒子的标准采样器。

Biosamler采样器是一款非常优秀的液体撞击式采样器，它的三头喷口会将采样液吹成一个巨大的漩涡，增大气体接触液体面，对脆弱的微生物（如病毒、立克次氏体）也能采样。

离心撞击式采样器主要有RCS型及国产的LWC-1、LWC-2型。

Biotest HYCON-RCS微生物空气采样器在国内应用较多，采样流量大、便携是其主要优点，但只有空气采样仪和标准配套的琼脂条相结合的完整Biotest HYCON-RCS系统存在时有效，无法使用多种检测方法处理样品。

静电采样器基本结构包括高压电源、放电电极、采集电极（即采集面）和抽气装置，具代表性的有LVS/10K大容量静电沉降采样器和小型圆管式静电沉着采样器。

4.2 生物气溶胶检测舱

为研制一种具备气流控制和温湿度检测功能的微环境密闭舱室用于生物气溶胶检测研究，李娜等利用风速传感器、温湿度传感器、电动调节阀、管道高效过滤器和真空泵组成控制系统，解决气流流向控制、温度补偿技术、压力控制和气溶胶均匀分布技术；并利用了Fluent软件对该密闭舱室气溶胶浓度分布状况进行数值模拟，并测试不同位置的气溶胶浓度[21]。研究结果表明，由一个气密舱和一个控制柜组成的微环境密闭舱室，其控制柜内采用单片机控制，并为气密舱提供送风、排风和温湿度调控，设有单独排风模式和自循环送排风模式，且舱内保持着负压状态。通过数值模拟结果表明，在微环境密闭舱室内生成气溶胶5 min后，气溶胶粒子分布于整个舱室，底部气流可到达舱室上方，舱室内气溶胶浓度分布基本一致。结论该微环境密闭舱室以负压状态运行，能够避免生物气溶胶泄露，气溶胶浓度分布比较均匀，适用于进行生物气溶胶检测研究。

5 展望

国门安全作为国家安全的重要组成部分，进出境人员、货物等的流通场所中的有害微生物不仅能够传播疾病，还可能造成工业设备加速腐蚀、食品变质，鲜活农产品品质受损等，其危害不可小觑。出入境微生物气溶胶的监测检测技术及装备的研究与推广应用对于加强国门生物安全体系建设，保障国门生物安全具有重要意义。

我国对微生物气溶胶研究起步较晚，大多集中在对空气中微生物气溶胶种类、含量及传播模式方面的研究，其他方面的研究有待进一步深入。在采集方法方面，应该研制更加先进、合理的微生物气溶胶采样设备，使采集到的样本更加准确和科学；在鉴定分离方法方面，因将现代生物学技术与传统方法更好地结合，使微生物分离鉴定更快捷、更精准；在研究内容方面，还需要建立进出境微生物气溶胶采集、检测、分析等方法的标准，并研究开发更绿色、安全、高效防控微生物气溶胶的制剂。