李玉婷，罗 乐，尹素娟，朱小兰

(1.永州职业技术学院 医学院，湖南 永州 425006；2.中南大学 药学院，湖南 长沙 410205)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)及其并发症急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrom,ARDS)是临床常见急危重症，也是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)危重症患者的主要临床症状，其病死率高达40%[1],目前除了保护性机械通气外暂无更好的药物治疗，因此研发安全有效的治疗药物具有重要意义[2]。前期研究发现，ALI的发病过程与氧化应激诱导的肺损伤相关。氧化应激使体内产生大量的活性氧，造成气管和血管重塑，侵袭肺间质导致肺水肿，并对肺实质细胞直接造成氧化损伤[3]。抗氧化蛋白Nrf2及HO1可抑制ALI的促炎细胞因子的关键信号因子——核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)的表达，在急性肺损伤中有着十分重要的作用[4-5]。

丹酚酸B(salvianolic acid B,SAB)是丹参中活性最强、含量最多的成分，前期研究已证实其能够促进沉默信息调节因子(silent information regulator 1，SIRT1)的表达，增强Nrf2的表达和转录活性，具有较强的抗氧化及清除体内氧自由基的作用[6]。因此，推测SAB的这种抗氧化机制具有减轻急性肺损伤的可能，本文研究旨在探讨SAB对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：丹酚酸B (纯度:>98% 上海北诺生物科技有限公司)；LPS(脂多糖，Sigma-Aldrich公司)；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、小鼠白细胞介素-6(IL-6)、小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物科技公司)；兔源Nrf2、兔源HO1、兔源NQO1、兔源Keap1兔源NF-κB、兔源p-NF-κB和鼠源β-肌动蛋白(β-actin)的抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)；其他试剂从北京定国长生生物科技有限公司获得。

1.1.2 实验动物：SPF级雄性BALB/c小鼠(年龄8～10周，体质量18～22 g)(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠随机分1)对照组(control组)；2)模型组(LPS组)气管滴注LPS(3 mg/kg)；3)、4)和5)组为SAB(5、15和30 mg/kg干预组)滴LPS后1 h静注；6)SFN组(莱菔硫烷，sulforaphane,SFN,5 mg/kg，作为阳性对照组)。每组8只，连续给药1周，实验第8天处死小鼠，进行相关指标检测。

1.2.2 组织病理学评估：将小鼠肺右中叶浸入4%多聚甲醛中，固定24 h，石蜡包埋，去石蜡和脱水，将肺切为5 μm切片，用苏木精和伊红(HE)染色。

1.2.3 肺湿/干重比值(W/D)测定：取左肺组织样品，切除，称重得肺湿重，置80 ℃ 的烤箱中，干燥48 h后，称重得肺干重，计算肺湿/干重比值。

1.2.4 肺泡灌洗液BALF中蛋白质浓度测定：用无菌磷酸盐缓冲液灌洗肺，将收集的BALF样品在4 ℃，3 000 r/min 离心10 min，收集上清液，用比辛酸(BCA)法定量测定其中总蛋白浓度。

1.2.5 ELISA测定 BALF中炎性细胞因子：采用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定BALF样品上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.2.6 肺匀浆氧化应激的评价：髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性是多形核白细胞活化和中性粒细胞实质浸润的重要指标，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是体内脂质过氧化的主要产物，可用于评价氧化应激状态下细胞受损伤的程度，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是机体内重要的抗氧化酶[7]，可评价机体内抗氧化作用的程度。采用肺组织匀浆测定以上氧化应激指标。将肺组织剪碎，用匀浆器制备成10%的匀浆，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液，按照MPO、MDA、SOD试剂盒说明书进行相应操作，计算含量。

1.2.7 免疫印迹法检测Nrf2、NQO1、HO1、Keap1、NF-κB及p-NF-κB蛋白：用 T-PER 组织蛋白质提取试剂盒从肺组织中提取蛋白质。用BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，蛋白质经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，将等量的蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用阻断液(5%脱脂牛乳)阻断膜2 h后，用TBST 冲洗3次，然后与抗Nrf2、NQO1、HO1、Keap1、NF-κB、p-NF-κB和NADPH的特异性抗体于4 ℃下孵育一夜，再用TBST缓冲液冲洗3次，将洗涤后的一抗反应膜放入稀释好的二抗(辣根过氧化物酶)工作液中，约1 h,再次用TBST洗涤膜。用增强型化学发光检测试剂对波段信号进行检测，使用 image J 分析软件对波段的相对吸光度值进行量化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SAB改善LPS诱导的肺组织病理学变化

模型组小鼠肺组织有明显的炎性细胞浸润、间质和肺泡水肿。SAB干预组能减轻LPS诱导的病理变化，肺泡间隔厚度减少，炎性细胞浸润程度降低，间质水肿减轻，肺损伤症状明显改善(图1)。

2.2 SAB减轻LPS诱导的肺水肿

模型组肺组织的W/D比值显著增加(P<0.05)。与模型组相比，SAB(5,15和30 mg/kg)干预组小鼠的肺W/D比值明显降低(P<0.05,P<0.01)，SFN组小鼠的肺W/D比值也明显减少(P<0.01)，且SAB对LPS诱导的肺水肿的减轻作用呈浓度依赖性(图2)。

2.3 SAB减轻LPS诱导的肺泡蛋白质渗出

模型组BALF中蛋白质含量显著增加(P<0.05)。与模型组相比，SAB(5、15和30 mg/kg)干预组的BALF中蛋白质含量下降(P<0.01)，SFN组的BALF中蛋白质含量也明显减少(P<0.01)(图3)。

2.4 SAB抑制BALF中TNF-α、IL-1β和 IL-6的含量

模型组的TNF-α、IL-1β和 IL-6炎性细胞因子含量均比对照组有明显升高(P<0.05)。与模型组相比，SAB(5、15和30 mg/kg)处理组的TNF-α、IL-1β和 IL-6含量均明显降低(P<0.05)，且SAB对TNF-α、IL-1β和 IL-6的抑制作用呈浓度依赖性增加(图4)。

2.5 SAB减轻LPS诱导的ALI小鼠氧化应激

与对照组相比，模型组小鼠肺组织 MPO活性、MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)。经SAB或SFN处理后，显著降低MPO活性、MDA含量，升高SOD活性(P<0.05)，且SAB的浓度越大，逆转的效果越明显(图5)。

A.control；B.model；C.SAB(5 mg/kg)；D.SAB(15 mg/kg)；E.SAB(30 mg/kg)；F.SFN(5 mg/kg)图1 SAB在 LPS 诱导的急性肺损伤模型中对肺病理组织学的影响Fig 1 Effect of SAB on lung histopathology in LPS induced acute lung injury(HE，×200)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图2 SAB对肺组织W/D比值的影响Fig 2 Effect of SAB on LPS induced lung W/D ratio

*P<0.05 compared with control group;#P<0.01 compared with model group图3 SAB对BALF中蛋白含量的影响Fig 3 Effect of SAB on protein content of BALF

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图4 SAB对急性肺损伤小鼠BALF中TNF-α、IL-6及IL-1β浓度的影响Fig 4 Effect of SAB on TNF-α、IL-6andIL-1β content in BALF of mice with acute lung

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图5 SAB对急性肺损伤小鼠肺组织MPO活性、MDA含量及SOD活性的影响Fig 5 Effects of SAB on MPO activity,MDA content and SOD activity in lung tissue of mice with acute

2.6 SAB对Nrf2信号通路和NF-κB的影响

与对照组相比，模型组的Nrf2、NQO1和HO1蛋白表达降低(P<0.05)，Keap1蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组相比，SAB处理后显著抑制了Keap1蛋白的表达(P<0.01)，有效地提高了Nrf2、NQO1和HO1蛋白的表达(P<0.05)。经LPS诱导后，p-NF-κB和NF-κB蛋白表达升高(P<0.05)，与模型组相比，SAB处理组p-NF-κB和NF-κB的蛋白表达降低，且两者比率呈降低趋势(图6)。

3 讨论

气管滴注LPS诱导小鼠急性肺损伤是目前较稳定且重复率较高的肺损伤建模方式[8～9]，本研究中，小鼠经LPS诱导后，肺组织产生明显的病理性变化，由此说明小鼠ALI建模成功。SFN曾作为Nrf2激活剂对LPS诱导的急性肺损伤有较好的保护作用[10]，其具有较强的抗氧化作用，因此，本次实验采用SFN作为阳性对照。

经LPS刺激，大量炎性细胞如中性粒细胞和巨噬细胞被激活，引发一系列ALI炎性级联反应。炎性细胞因子TNF-α、1L-6和1L-1β来源于活化的中性粒细胞和巨噬细胞，其不仅能放大炎性级联反应引起炎性损伤，还能将中性粒细胞吸收到肺中，增加MPO活性，如研究所示，SAB能抑制MPO活性，显著抑制BALF中的炎性细胞因子含量，SAB对LPS诱导的ALI减轻作用可归因于此。

在正常生理状态下，氧化剂和抗氧剂处于平衡状态[11]，本研究表明SAB能恢复氧化剂和抗氧化化剂平衡，减轻LPS诱导的ALI小鼠氧化应激损伤。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with model group图6 SAB对LPS诱导小鼠Nrf2、NQO1、HO1、Keap1、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达的影响及Western blot分析与定量密度分析Fig 6 Effect of SAB on the expression of Nrf2,NQO1,HO1,Keap1,NF-κB and p-NF-κB proteins in LPS-induced mice and Western blot analysis and quantitative density n=8)

基于上述结果，本研究团队探讨了SAB减轻急性肺损伤的作用机制。在稳态条件下，Nrf2表达较低[12]。在氧化应激下，Nrf2从Keap1释放并转移到细胞核中，促进内源性抗氧化解毒蛋白如HO1和NQO1的表达，减少氧化应激损伤。NF-κB是调节促炎细胞因子的关键信号因子，氧化应激导致NF-κB激活，NF-κB核易位的抑制降低了NF-κB依赖的促炎介质的表达，从而改善急性肺损伤的严重程度。本研究结果表明SAB能有效抑制NF-κB活性和NF-κB磷酸化(图7)，因此，本课题组推测，SAB可能通过调节Nrf2信号通路，抑制NF-κB，从而减轻炎性反应和氧化应激损伤，达到抑制急性肺损伤的目的。

图7 SAB减轻急性肺损伤作用机制Fig 7 Mechanism of SAB in alleviating acute lung injury

综上所述，SAB可减轻LPS诱导的急性肺损伤，本研究为SAB下一步开发及急性肺损伤治疗提供了实验依据。