彭海莹 田叶韩 李晓芳 张蕊 王德浩 梁元存 高克祥

摘  要：针对烟草黑胫病和根黑腐病两种烟草土传病害日益加重的现状，利用生防真菌棘孢木霉MX菌株和产紫青霉Q2菌株分别与植物诱抗剂氨基寡糖素进行组合，在盆栽条件下测定了其分别在两种病害胁迫下的抗病效果。结果表明，产紫青霉Q2和棘孢木霉MX对烟草黑胫病菌和根黑腐病菌均有较强的拮抗作用，其发酵滤液能有效抑制两种病原菌的生长，与氨基寡糖素组合后能够更好地促进烟草幼苗的生长，对黑胫病和根黑腐病的防治效果均达到65%以上，能显著提高发病烟草中防御酶PAL、SOD、POD的活性。

关键词：烟草黑胫病;烟草根黑腐病;棘孢木霉;产紫青霉;氨基寡糖素;生物防治

Abstract： The present situation of two kinds of tobacco soil-borne diseases， black shank disease and root black rot disease， is increasing， which greatly aggravates the degree of tobacco diseases. In this study， two excellent biocontrol strains， Penicillium purpurogenum strain Q2 and Trichoderma asperellum strain MX， were used to combine with amino oligosaccharides， a plant inducer of disease resistance， respectively. Effects on tobacco growth promoting and control efficacy of tobacco black shank and black root rot have been investigated by two fungal biocontrol agents and their combination with amino oligosaccharides in the potting experiment. The results showed that P. purpurogenum strain Q2 and T. asperellum strain MX had strong antagonism against P. parasitica var. nicotianae and T. basicola， and the combination of them and amino oligosaccharides could better promote the growth of tobacco seedlings， and the control effect on the tobacco black shank and black root rot was more than 65%， which could significantly improve the activities of PAL， SOD and POD in the diseased tobacco.

Keywords： tobacco black shank; tobacco black root rot; Trichoderma asperellum; Penicillium purpurogenum; amino oligosaccharide; biological control

煙草黑胫病是由寄生疫霉菌烟草致病变种（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的土传卵菌病害[1-3]，当环境条件有利时，任何生长阶段都可发生。生长季节普遍存在的高温高湿环境条件有利于病原菌的生长繁殖，使烟草黑胫病成为最难控制的疾病之一[4]。烟草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的土传真菌病害，给烟草造成了不同程度的损失，已经成为世界性的主要烟草根茎病害之一。在田间，根黑腐病经常与烟草黑胫病同时发生，使危害程度加重，防治也更加困难[5-7]。目前的防治措施主要为化学防治，但化学农药的大量施用，不仅增加成本，也会危害环境及人体健康。并且已有研究发现烟草黑胫病菌对烯酰吗啉和甲霜灵等化学农药出现抗性风险[8-9]，因此探索生物防治尤为重要[10-11]。

青霉菌的许多菌株能产生有机酸等有益物质，具有较好的抑制病原菌和促进作物生长的作用，可用于作物病害的生物防治[12-13]。木霉菌是目前防治植物病害最有应用前途的生防真菌，研究发现木霉菌是一种相当特异的真菌寄生菌，木霉菌产生的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶，能够降解宿主真菌的细胞壁[14]，并且木霉对根系生长发育有积极作用，可以提高作物生产力和养分吸收，是一种优良的生防真菌。

单独使用生防菌会出现防效不稳定、防效较低等问题，氨基寡糖素作为一种植物诱抗剂，能够激发植物体产生防御反应从而减轻病原菌对植物的侵害[15-16]。已有研究证实生防菌与植物诱抗剂复配能有更好的防病促生效果，比如金龟子绿僵菌加枯草芽孢杆菌与氨基寡糖素组合后能促进番茄植株的生长，番茄增产率达29.84%[17]。本试验用棘孢木霉菌和产紫青霉菌分别与氨基寡糖素组合使用，探索其对烟草黑胫病和根黑腐病的防治效果，以期为烟草黑胫病和根黑腐病等土传病害的生物防治提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料、时间

供试菌株：棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）MX菌株、产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）Q2菌株、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）Ppn菌株和根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）Tb菌株均由本实验室分离保存。

供试烟草品种为NC89，供试药剂为5%氨基寡糖素水剂，由海南正业中农高科股份有限公司生产。

供试培养基：PDA培养基，PDB培养基，燕麦培养基，V8培养基[18-19]。

试验于2018年7月—2019年11月在山东农业大学山东省蔬菜病虫生物学重点实验室进行。

1.2  试验方法

1.2.1  平板对峙试验  采用平板对峙法[19]。将烟草黑胫病菌和根黑腐病菌分别与棘孢木霉菌MX和产紫青霉菌Q2做平板对峙，以只接种病原菌的平板作为对照（CK），计算两种生防真菌分别对病原菌的抑制率。

1.2.2  生防菌发酵滤液对两种病原菌菌丝生长的影响  发酵滤液的制备：选取在PDA上生长良好的产紫青霉Q2和棘孢木霉MX，打取菌饼，每瓶PDB培养基接种3个菌饼，28 ℃、180 r/min振荡培养，木霉MX培养5 d，青霉Q2培养7 d，3层纱布过滤，弃菌丝，将滤液在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，用孔径为0.22 μm细菌过滤器过滤后得到无菌发酵滤液，4 ℃保存备用。

将90 mL定量PDA培养基加热熔化后冷却至45 ℃时，加入10 mL无菌发酵滤液混合均匀，发酵滤液终浓度为10%;对照组（CK）加入等量无菌水。在培养皿中心接种病原菌菌饼，27 ℃条件下培养7 d，测量菌落半径并计算抑制率[19]。

1.2.3  生防菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响  制备根黑腐病菌分生孢子悬浮液和黑胫病菌游动孢子悬浮液，取15 μL病原菌孢子悬浮液滴于载玻片中央，不同处理分别加入15 μL的Q2和MX发酵滤液，对照组（CK）加入等量无菌水代替发酵滤液，各组重复3次，采用载玻片悬滴保湿法，25 ℃培养，待对照组的孢子约有60%～80%萌发时，统计各处理视野内孢子总数以及萌发数，并计算孢子萌发抑制率：抑制率=（對照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率）/对照组孢子萌发率×100%

1.2.4  生防菌与氨基寡糖素的相容性试验  将5%氨基寡糖素水剂产品用无菌水稀释1000倍。90 mL定量PDA培养基加热熔化后加入10 mL配制好的氨基寡糖素，混合均匀，以不加氨基寡糖素而加入10 mL无菌水为对照。每培养皿倒入25 mL培养基，晾凉后在平板中心接种直径5 mm的青霉Q2和木霉MX菌饼，27 ℃黑暗培养，青霉培养10 d，木霉培养6 d，测量菌落直径并拍照，观察青霉Q2和木霉MX与氨基寡糖素是否具有相容性。

1.2.5  生防菌及其与氨基寡糖素组合对烟草幼苗促生效果试验  在口径为15 cm的花盆中放入500 g健康土，设置6个处理：①清水对照（CK）;②A，氨基寡糖素;③Q2+A，青霉Q2孢子+氨基寡糖素;④Q2，青霉Q2孢子;⑤MX+A，木霉MX孢子+氨基寡糖素;⑥MX，木霉MX孢子。青霉Q2孢子施用方法为在幼苗移栽前取10 mL孢子悬浮液（浓度为1×107 cfu/mL）均匀拌入土中，使土中青霉Q2孢子浓度为2×105 cfu/g;木霉MX孢子施用方法为取浓度为1×108 cfu/g的孢子粉进行穴施，每穴2 g。两种生防菌使用浓度均为在本试验前期筛选过的最佳浓度。选取健康、长势一致的烟苗进行移栽，移栽后相应处理每株喷施稀释1000倍的氨基寡糖素液10 mL。每处理12株，设3个重复。本试验在人工温室中进行，保证各处理温度及水分管理一致。在移栽30 d后测量株高、茎粗、叶片数、最大叶长和叶宽等生长指标，40 d时测定烟株地上部和地下部鲜质量和干质量并参考赵成刚[20]的方法计算根冠比。

1.2.6  生防菌及其与氨基寡糖素组合对烟草黑胫病和根黑腐病的防治效果试验  （1）对烟草黑胫病的防治效果：在规格为70 cm×40 cm×10 cm的方形塑料盆中装入4 kg健康土，每盆种18株烟苗作为一个处理，重复3次。共设置7个处理，分别为：①CK0：空白对照不加病原菌;②CK1：加病原菌，每株灌根接种浓度为2×105 cfu/mL黑胫病菌的游动孢子悬浮液10 mL;③A：病原菌+氨基寡糖素;④Q2+A：病原菌+青霉Q2孢子+氨基寡糖素;⑤Q2：病原菌+青霉Q2孢子;⑥MX+A：病原菌+木霉MX孢子+氨基寡糖素;⑦MX：病原菌+木霉MX孢子。移栽前在土壤中加入生防菌，移栽烟苗时伤根并加入病原菌，烟苗移栽后喷施氨基寡糖素。氨基寡糖素施用方法同1.2.5;青霉Q2孢子施用方法：在幼苗移栽前取80 mL孢子悬浮液（浓度为1×107 cfu/mL）均匀拌入土中，使土中青霉Q2孢子浓度为2×105 cfu/g;木霉MX孢子施用方法：取稀释浓度为1×108 cfu/g的孢子粉进行穴施，每株2 g。接种15 d后，采用国家标准GB/T 23222—2008《病害分级标准》，调查各处理的发病率和病情指数，并计算防治效果。

（2）对烟草根黑腐病的防治效果：用灌根法每株接种10 mL浓度为2×105 cfu/mL的根黑腐病菌分生孢子悬浮液，各处理的设计和药剂用量与方法同上。接种后21 d，采用GB/T 23222—2008《病害分级标准》，计算各处理的发病率、病情指数以及防治效果。

1.2.7  生防菌及其与氨基寡糖素组合处理烟草中防御酶的测定  分别在1.2.6试验中烟苗移栽后1、3、5、7、9 d五个时间点取样，每处理随机取3株烟苗，液氮研磨后?80 ℃保存，用于以下防御酶活性的测定，每试验重复3次。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）的测定参考曹建康等的方法[21]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性的测定采用北京索莱宝科技有限公司的检测试剂盒，具体方法参考产品说明书。

1.3  数据统计处理

采用Excel 2007进行数据处理和绘图，用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行方差分析和差异显著性检验，图表中数据为平均值±标准差。

2  结  果

2.1  生防菌对病原菌的拮抗能力

平板对峙试验结果显示（表1），由于木霉MX生长速度较快，迅速抢占病原菌的生存空间，对病原菌的平板拮抗效果较好，其中对黑胫病菌的抑制率为80.43%，对根黑腐病菌的抑制率为73.58%，青霉Q2由于生长速度小于木霉，其平板抑制率略低。说明Q2和MX对两种病原菌的生长都有拮抗作用。

从表2可以看到，烟草黑胫病菌和根黑腐病菌在含有不同真菌发酵滤液培养基中生长7 d后，MX滤液对于烟草黑胫病菌菌丝生长影响很小，而Q2滤液则具有很强抑制作用，抑制率为61.72%，与对照相比差异显著。对于根黑腐病菌的菌丝生长，MX滤液和Q2滤液的抑制效果都比较显著，其中Q2滤液抑制率远高于MX滤液。表明Q2滤液较MX滤液有更强的抑制两种病原菌菌丝生长的能力。

对于黑胫病菌游动孢子和根黑腐病菌分生孢子的萌发，Q2和MX发酵滤液均有不同程度的抑制作用（表3），以Q2发酵滤液最为显著。其中Q2滤液处理的黑胫病菌游动孢子萌发率比CK低40.25百分点，而MX发酵滤液对游动孢子萌发的影响较小，仅比CK低7.40百分点。用Q2滤液处理后根黑腐病菌分生孢子萌发极少，比CK的萌发率降低86.14百分点，而MX滤液处理后孢子萌发率稍有下降，仅比CK降低13.41百分点。说明与木霉MX菌株相比，青霉Q2菌株的发酵滤液对病原菌孢子萌发有更强的抑制作用，能够抑制病原菌的生长繁殖从而影响其对植株的侵染。

2.2  生防菌与氨基寡糖素的相容性

从图1中可以看出，加入氨基寡糖素（A）并没有影响棘孢木霉MX菌株和产紫青霉Q2菌株的菌丝生长，与对照的菌落大小没有差别;但是木霉MX在加入氨基寡糖素的培养基中菌丝茂密且生长旺盛，中间已经开始产孢，较CK来说有更早产孢的趋势，青霉Q2在含有氨基寡糖素的培养基中生长较好，且产生具有杀菌效果的紅色物质。说明氨基寡糖素与木霉MX菌株和青霉Q2菌株有较好的相容性，可以组合使用。

2.3  生防菌及其与氨基寡糖素组合对烟草幼苗生长的影响

移栽后30 d的调查结果显示（表4），各个处理的烟株各项农艺性状与对照相比均有不同程度的提高，其中以MX+A处理的效果最为显著，其株高、茎粗、叶长、叶宽分别比CK处理提高了57.10%、20.21%、33.62%、35.08%，其次是Q2+A和MX处理，这两个处理效果差异不明显，然后是Q2和A。

不同处理的烟株鲜质量和干质量与对照组相比都有显著性提高，其中A、Q2+A、Q2、MX+A、MX处理组的鲜质量分别比CK处理增加了14.75%、25.76%、25.26%、32.26%、27.44%，干质量分别比CK增加了21.81%、39.36%、29.26%、52.13%、46.28%，MX+A对于增加鲜质量和干质量的效果最好，其次是MX和Q2+A。加入MX和Q2还能提高烟草的根冠比，其中MX的效果优于Q2。

以上说明木霉MX菌株的促生效果优于青霉Q2菌株，喷施氨基寡糖素能较好地促进烟草的生长，其与生防菌MX和Q2组合能产生更好的促生效果。

2.4  生防菌及其与氨基寡糖素组合对烟草黑胫病和根黑腐病的防治效果

在温室栽苗15 d后对烟草黑胫病进行病情调查（表5），CK0处理烟苗无发病，CK1处理全部发病，用Q2处理的烟苗发病率最低，为39.39%，其次是用MX处理的，发病率为51.52%。氨基寡糖素对发病率影响较小，但是能够有效降低病情指数。Q2和MX分别与氨基寡糖素组合后防病效果都好于单独施用，其中Q2+A防病效果最好。说明青霉Q2菌株和木霉MX菌株对防治烟草黑胫病都有较好的效果，与氨基寡糖素组合防病效果更佳。

在温室栽苗21 d后对根黑腐病进行病情调查（表5），结果显示CK1处理发病率为84.85%，单独使用氨基寡糖素后发病率稍有下降，为75.76%，防病效果为49.46%，且能有效降低病情指数。Q2+A处理和Q2处理的发病率差别较小，而MX与氨基寡糖素组合则有效降低了发病率。说明青霉Q2菌株和木霉MX菌株对烟草根黑腐病的防治效果相近，但与氨基寡糖素组合后能发挥更好的防病作用。

2.5  生防菌及其与氨基寡糖素组合处理对发病烟草中防御酶的影响

由图2可见，在接种烟草黑胫病菌后，各生防菌及与氨基寡糖素组合处理的PAL、POD、SOD活性均高于空白对照CK0和病原对照CK1。Q2+A处理的PAL、POD、SOD活性分别在第9、5、3天达到峰值，比CK1处理提高了61.66%、36.07%、85.21%。

而接种烟草根黑腐病菌后，各个处理的PAL、POD、SOD活性总体均呈先升高后下降趋势，空白对照CK0处理的活性一直保持较低水平且比较稳定。PAL、POD、SOD活性分别在第5、3、5天时达到峰值，且均为Q2+A处理的活性最高，分别比CK1处理高出43.30%、44.44%、59.13%（图2）。综合来看，在黑胫病菌和根黑腐病菌胁迫下，青霉Q2菌株和木霉MX菌株与氨基寡糖素组合都能够诱导烟草组织内PAL、POD、SOD活性的提高，从而在烟草遭受病原菌侵害时增强其抗病性。

3  讨  论

有益的土壤微生物群体对于作物土传病害有一定程度的抑制作用[22]，选择优良的拮抗菌对防治土传病害具有重要意义，青霉菌和木霉菌作为优良拮抗菌已有较多研究报道。WONGLOM等[23]研究表明，木霉菌T76-12/2释放的挥发物抑制了菌核病菌LS01和SZ01的菌丝生长，抑制率分别为81.48%和78.33%。本试验初步验证了产紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株分别对烟草黑胫病菌和根黑腐病菌有较强的拮抗作用，青霉Q2的发酵滤液与木霉MX发酵滤液相比有更强的抑菌效果，能有效抑制两种病原菌的菌丝生长、根黑腐病菌孢子萌发、黑胫病菌孢子囊产生以及游动孢子萌发，证明青霉Q2菌株和木霉MX菌株能有效抑制病原菌的生长和繁殖，为产紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株作为优良拮抗菌提供了理论依据。

青霉菌和木霉菌除有较好的防病作用外，还能促进各类植物的生长。有研究证明木霉菌对烟草黑胫病有较好的防效，并能促进烟草种子萌发和根系生长[24]。王海波等[13]温室试验证明青霉QMYCS-2菌株发酵滤液能有效防治烟草黑胫病，防效达73.25%。与其相似，本试验在分别施加青霉Q2或木霉MX后都促进了烟草幼苗的生长，有效降低烟草黑胫病和根黑腐病的发病率和病情指数。生防菌与氨基寡糖素组合后表现出更好的促生防病效果。但是，在本试验中生防菌用量和施加时期的设置较为单一，没有对适合烟草生长的生防菌最佳浓度进行筛选，对于氨基寡糖素的用量，本试验采用了产品说明书中参考浓度范围的较低值，缺乏生防菌与氨基寡糖素的最佳配比研究，这需要在后期田间应用时进一步试验。

植物与病原菌互作是一个复杂的过程，在植物的抗病性中防御酶起着至关重要的作用[25]。諸多研究证实PAL、SOD、POD活性的升高均能反映植株抗病性的增强。NARAYAN等[26]研究表明，生防菌通过增强抗氧化酶防御系统帮助植物克服病害胁迫，生物保护作用是通过系统诱导宿主植物的抗氧化防御来介导的。本试验在分别接种烟草黑胫病菌和根黑腐病菌后，青霉Q2菌株和木霉MX菌株与氨基寡糖素组合使用后，均能有效诱导烟草植株内PAL、SOD、POD活性的升高，从而增强烟草的抗病性。生防菌对于烟草黑胫病和根黑腐病植株的各项生理反应有较大影响，原因可能是病原菌被青霉Q2菌株及其次生代谢产物抑制从而减少了其对根部和植株的侵染，而木霉MX菌株则可能是因为其易在根部定殖，与病原菌抢占生长位点，从而有效促进植株生长并抵御病原菌的危害。但产紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株与植物和病原菌之间的互作关系以及抗病机理还需深入的研究。

4  结  论

研究结果显示拮抗真菌与氨基寡糖素组合后能有效促进烟草植株的生长，对黑胫病和根黑腐病有良好的防治效果，并且能在病原菌胁迫下提高烟草的防御酶活性从而增强其抗病性，为烟草病害的生物防治提供了思路和方法。

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