陈海元 朱晓妹 张所兵 张云辉 方先文

摘要：通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变水稻品种南粳46，发现2个可以稳定遗传的叶片卷曲变窄的突变体rnl1-1（rolling and narrow leaf1-1）和rnl1-2。与野生型相比，突变体从苗期开始表现出叶片卷曲变窄的表型，一直持续到成熟期。此外，突变体抽穗期延迟，株高、穗长、剑叶长、剑叶宽、一次枝梗数、二次枝梗数、粒厚、每穗粒数和粒宽均显著降低。遗传分析表明，突变体的突变表型受1对隐性基因控制。利用rnl1-1与籼稻品种Dular杂交建立F2群体，将该基因定位在水稻第12染色体长臂上的InDel标记HF36和HF43之间约277 kb 的区间内。该区间内NRL2基因突变引起的表型与rnl突变体相似，测序发现rnl1-1突变体中RNL2基因的第1708位核苷酸由C突变为T，使得编码的氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸;rnl1-2突变体中RNL2基因的第2011位核苷酸由G突变为A，使得编码的氨基酸由精氨酸突变成甘氨酸。

关键词：水稻;叶片卷曲变窄;突变体;基因定位;NRL2

中图分类号：S511.01 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）02-0037-06

收稿日期：2020-04-10

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK20180309）。

作者简介：陈海元（1988—），男，江苏徐州人，博士，助理研究员，主要从事水稻基因功能解析及分子设计育种研究。Tel：（025）84390321;E-mail：15150530179@163.com。

通信作者：方先文，博士，研究员，主要从事水稻品种资源研究。Tel：（025）84390321;E-mail：2431240491@qq.com。

细胞壁决定了植物的株型、生长、发育以及对生物和非生物胁迫的响应，纤维素、半纤维素和果胶是植物细胞壁的主要成分[1]。高等植物中，纤维素由β-1，4-葡聚糖链组成，在细胞膜上由纤维素酶复合体合成。复合体包括6个亚基，一般含有36个纤维素合成酶蛋白分子[2]。纤维素合酶（cellulose synthase，简称CESA）属于糖基转移酶家族2，具有8个跨膜结构域，其中2个跨膜域靠近N端，6个跨膜域靠近C端，中间为保守的“D，D，D，QXXRW”基序和糖基转移酶结构域[3]。纤维素合成酶类似蛋白（cellulose synthase-like，简称CSL）参与半纤维素骨架的合成，CSL蛋白与 CESA蛋白的序列高度同源，被分为9个亚族：CSLA～H 和 CSLJ[4]。一些CSL家族的功能已经被阐明，CSLA家族成员编码甘露聚糖合成酶[5]，CSLC 与木葡聚糖合成相关[6]，CSLF和CSLH家族参与多种葡聚糖的合成[7-8]。CSL亚家族中，CSLD与CESA亚族高度相似，因此认为CSLD可能与纤维素合成酶功能相似[9]。拟南芥KOJAK/AtCSLD3是第1个被克隆的CSLD亚族成员，参与早期根毛的发育[10-11]。AtCSLD2参与晚期根毛的发育[12]。AtCSLD1和AtCSLD4参与纤维素的沉积和花粉管的生长[13]。玉米ZmCSLD1对于细胞分裂至关重要，zmcsld1突变体中细胞变小且数目减少，导致器官变窄[14]。水稻CSLD亚族共有5个成员，其中OsCSLD1是KOJAK/AtCSLD3的同源基因，参与水稻根毛的发育[15]。OsCSLD4参与细胞壁的形成和植株生长[16-21]。

本研究通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变粳稻品种南粳46，获得2个稳定遗传的叶片卷曲变窄突变体，从表型、遗传等方面明确突变体的遗传特性，并对突变基因进行精细定位、基因测序与突变位点分析。通过对该突变体的研究，有利于进一步了解水稻株型的分子机制，为株型育种提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

通过EMS诱变粳稻品种南粳46，鉴定出2份水稻叶片卷曲变窄的突变体，依据表型分别将其命名为rnl1-1和rnl1-2。经过多代自交后，rnl1-1和rnl1-2突变体叶片卷曲变窄的性状被稳定遗传。

1.2農艺性状考察

2018年5月中旬，将野生型（WT）和rnl1-1和rnl1-2播种，1个月后移栽于大田，期间考察苗期性状。正常水肥条件下生长至黄熟期，随机选取野生型和rnl1-1突变体各10株，考察株高、分蘖数、剑叶长宽、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗粒数、结实率、粒长、粒宽和粒厚等农艺性状。

1.3遗传分析与基因定位

2017年南京正季以rnl1-1突变体为母本，分别与野生型、粳稻品种中花11（ZH11）和籼稻品种Dular杂交获得F1代种子，随后在海南加代，获得用于遗传分析和基因定位的F2群体的种子，F2群体于2018年南京正季种植。rnl1-1与野生型、ZH11及Dular杂交构建F2群体，统计其叶片卷曲变窄的植株和叶片正常植株的比率，并用卡方测验分析统计结果。在rnl1-1与Dualr杂交构建的F2群体中，筛选隐性极端个体687个，用于连锁分析与基因定位。首先选取10个极端个体，用均匀分布在水稻12条染色体上的南粳46和Dular之间多态性好的简单重复序列（SSR）标记进行连锁分析，对突变基因进行初定位。在初定位区间内，寻找其他有多态的SSR标记或者InDel标记，分析其他极端个体，完成突变基因的精细定位。

1.4突变基因的鉴定与验证

通过水稻基因组注释计划（Rice Genome Annotation Project，https：//rapdb.dna.affrc.go.jp）对精细定位区间内的基因进行预测，发现区间内存在1个已经报道的叶片发育相关基因NRL2（Os12g0555600），因此开发了8对引物对2个rnl1突变体中Os12g0555600基因的基因组（包含启动子和基因编码区）进行测序，并与野生型序列进行比对，并在定位群体中随机挑选10个隐性极端个体对突变位点进行验证。

2结果与分析

2.1突变体的表型分析

rnl1-1和rnl1-2突变体在苗期时叶片就表现出卷曲变窄的表型（图1-A、图1-E、图1-F），分蘖期时不同叶位的叶片也表现出类似的表型（图1-B、图1-C、图1-D、图1-G）。

rnl1-1突变体的抽穗期比野生型延迟约9 d（图2-A，图3），成熟期时的株高较野生型也明显下降（约下降20 cm，图2-B）。对野生型和rnl1-1突变体主茎的穗子和各个节间长度进行比较，发现rnl1-1突变体的穗长和各个节间的长度较野生型都显著降低，第1节间和第2节间长度的减少是导致突变体株高下降的主要原因（图2-C、图2-D）。

对野生型和rnl1-1突变体的其他农艺性状进行分析，发现rnl1-1突变体的株高、穗长、剑叶长、剑叶宽、每穗粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、粒宽和粒厚较野生型都显著下降，而粒长和结实率没有明显变化（图3）。

2.2遗传分析

将rnl1-1分别与野生型、粳稻品种ZH11和籼稻品种Dular杂交，其F1的叶片发育正常。rnl1-1/WT、rnl1-1/ZH11和rnl1-1/Dular的F2群体中，叶片卷曲变窄的植株与叶片正常发育的植株的比率符合3 ∶1的分离比（表1），表明叶片卷曲变窄的表型受1对隐性基因控制。

2.3连锁分析与精细定位

用rnl1-1和Dular作为DNA模板，用463对SSR引物进行多态性分析，得到155对多态性较好的引物，多态性频率为33.48%。用这些引物对rnl1-1/Dular F2群体中随机挑选的10个与突变体表型相似的极端个体进行连锁分析，发现突变基因与水稻第12染色体长臂上的2个分子标记RM519和RM6947紧密连锁。根据已经公布的日本晴和9311DNA序列，在此区间内又开发了3个多态性好的标记HF36、HF43和RM28466（表2）。

2.4候选基因分析

对定位区间内的基因进行分析，发现NRL2基因的突变表型与rnl1-1相似，因此对rnl1-1突变体中的NRL2基因进行测序，结果显示，rnl1-1突变体中RNL2基因的第1 708位核苷酸由C突变为T，使得编码的氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸;rnl1-1 突变体中RNL2基因的第2011位核苷酸由G突变为A，使得编码的氨基酸由精氨酸突变成甘氨酸。从rnl1-1/Dular F2群体中随机挑选的10个极端个体进行混池测序，结果表明10个极端个体的RNL2基因具有与rnl1-1相同的突变位点。

利用这些标记对rnl1-1/Dular F2群体中的576个极端个体进行分析，最终将突变基因限定在分子标记HF36和HF43之间，物理距离约为277 kb（图4-A）。

3讨论与结论

水稻OsCSLD4/NRL1基因是CSLD家族的一员，主要在快速生长的器官（如根、叶和穗）中高度表达[17-18]。进一步研究表明，OsCSLD4正在分裂细胞的M期特异表达[20]，其蛋白定位于高尔基体中[16]。OsCSLD4/NRL1SLE1基因在细胞壁的生物合成及植株的生长发育中起关键作用。通过不同的方法已经鉴定出了一些该基因的突变体，这些突变体的共同特征是植株矮化，叶片卷曲变窄。此外，由于诱变材料背景或者基因突变位点的不同（表3），不同突变体的表型也有一定的差异。nd1突变体中，2 894位点核苷酸C-T的突变使编码的氨基酸发生 Ala-Val 的替换，导致茎和根的初生细胞壁结构均异常，株高降低，叶片卷曲变窄[16]。nrl1突变体中，2 431～2 489位点缺失59 bp核苷酸，使得编码的蛋白质部分氨基酸移码突变和提前终止，除了株高降低和叶片卷曲变窄外，突变体还表现出叶片夹角增大、根系发育异常和结实率显著下降[17]。nrl1-1变体中，592位点核苷酸T-C的突变使编码的氨基酸发生Leu-Ser的替换;nrl1-2变体中，1 314位点核苷酸G-A的突变使编码的氨基酸发生Ala-Thr的替换;nrl1-3突变体中，3 360位点核苷酸 G-A 的突变使翻译提前终止，3个突变体的叶片都卷曲变窄，株高有不同程度的下降[18]。cd1突变体中，396～397位点核苷酸之间插入了8 bp核苷酸，使部分氨基酸移码突变，翻译提前终止，由于灌浆不充分导致突变体种子细小、皱缩[19]。sle1-1突变体中，887～930位点缺失了 44 bp 核苷酸，961位点核苷酸发生G-A的突变，使翻译提前终止;sle1-2突变体中，2 960位点核苷酸C-A的突变引起编码氨基酸Ser-Tyr的替换，sle-2突变体还具有花粉发育异常和花药开裂障碍等表型[20]。这些突变体的表型特征提示，OsCSLD4在水稻生长发育的调解中具有多效性作用。

与野生型相比，本研究获得的rnl1-1突变体抽穗期延迟9 d，株高是野生型的77.58%，叶片卷曲变窄，株高、穗长、每穗粒数、剑叶长、剑叶宽、一次枝梗数和二次枝梗数、粒宽、粒厚显著减少，但是结实率正常（图3）。此外突变体的粒宽显著下降，粒长和粒厚没有顯著差异（图3）。已经报道的OsCSLD4基因的突变体中，rnl1-1的表型与nrl1-1、nrl1-2和nrl1-3突变体的表型相似，虽然突变体的各个器官变小或变窄，但是植株的结实率并未受到影响，而nrl和sle突变体的结实率显著下降，cd1突变体种子皱缩，表明OsCSLD4基因的完整结构对水稻正常生长发育是必需的，单个氨基酸的突变会导致株高下降，叶片卷曲变窄，氨基酸序列的截短会使植株生长受到严重影响，因此该基因不同结构域功能的研究对于株型育种具有重要意义。

参考文献：

[1]Reiter W D. Biosynthesis and properties of the plant cell wall[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（6）：536-542.

[2]Mutwil M，Debolt S，Persson S. Cellulose synthesis：a complex complex[J]. Current Opinion in Plant Biology，2008，11（3）：252-257.

[3]Sethaphong L，Haigler C H，Kubicki J D，et al. Tertiary model of a plant cellulose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（18）：7512-7517.

[4]Farrokhi N，Burton R A，Brownfield L，et al. Plant cell wall biosynthesis：genetic，biochemical and functional genomics approaches to the identification of key genes[J]. Plant Biotechnology Journal，2006，4（2）：145-167.

[5]Liepman A H，Wilkerson C G，Keegstra K. Expression of cellulose synthase-like （Csl） genes in insect cells reveals that CslA family members encode mannan synthases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（6）：2221-2226.

[6]Cocuron J C，Lerouxel O，Drakakaki G，et al. A gene from the cellulose synthase-like C family encodes a β-1，4 glucan synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（20）：8550-8555.

[7]Burton R A，Wilson S M，Hrmova M，et al. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall （1，3;1，4）-β-D-glucans[J]. Science，2006，311（5769）：1940-1942.

[8]Doblin M S，Pettolino F A，Wilson S M，et al. A barley cellulose synthase-like CSLH gene mediates （1，3;1，4）-β-D-glucan synthesis in transgenic Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（14）：5996-6001.

[9]Carroll A，Specht C D. Understanding plant cellulose synthases through a comprehensive investigation of the cellulose synthase family sequences[J]. Frontiers in Plant Science，2011，2（5）：5.

[10]Wang X，Cnops G，Vanderhaeghen R，et al. AtCSLD3，a cellulose synthase-like gene important for root hair growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2001，126（2）：575-586.

[11]Favery B，Ryan E，Foreman J，et al. KOJAK encodes a cellulose synthase-like protein required for root hair cell morphogenesis in Arabidopsis[J]. Genes & Development，2001，15（1）：79-89.

[12]Bernal A J，Yoo C M，Mutwil M，et al. Functional analysis of the cellulose synthase-like genes CSLD1，CSLD2，and CSLD4 in tip-growing Arabidopsis cells[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1238-1253.

[13]Wang W，Wang L，Chen C，et al. Arabidopsis CSLD1 and CSLD4 are required for cellulose deposition and normal growth of pollen tubes[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（14）：5161-5177.

[14]Hunter C T，Kirienko D H，Sylvester A W，et al. Cellulose synthase-like D1 is integral to normal cell division，expansion，and leaf development in maize[J]. Plant Physiology，2012，158（2）：708-724.

[15]Kim C M，Park S H，Je B I，et al. OsCSLD1，a cellulose synthase-like D1 gene，is required for root hair morphogenesis in rice[J]. Plant Physiology，2007，143（3）：1220-1230.

[16]Li M，Xiong G Y，Li R，et al. Rice cellulose synthase-like D4 is essential for normal cell-wall biosynthesis and plant growth[J]. Plant Journal，2009，60（6）：1055-1069.

[17]Wu C，Fu Y，Hu G，et al. Isolation and characterization of a rice mutant with narrow and rolled leaves[J]. Planta，2010，232（2）：313-324.

[18]Hu J，Zhu L，Zeng D，et al. Identification and characterization of NARROW AND ROLLED LEAF 1，a novel gene regulating leaf morphology and plant architecture in rice[J]. Plant Molecular Biology，2010，73（3）：283-292.

[19]Luan W J，Liu Y Q，Zhang F X，et al. OsCD1 encodes a putative member of the cellulose synthase-like D sub-family and is essential for rice plant architecture and growth[J]. Plant Biotechnology Journal，2011，9（4）：513-524.

[20]Yoshikawa T，Eiguchi M，Hibara K，et al. Rice slender leaf 1 gene encodes cellulose synthase-like D4 and is specifically expressed in M-phase cells to regulate cell proliferation[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64（7）：2049-2061.

[21]Ding Z，Lin Z F，Li Q，et al. DNL1，encodes cellulose synthase-like D4，is a major QTL for plant height and leaf width in rice （Oryza sativa L.）[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2015，457（2）：133-140.李長洲，袁国印，王一柳，等. 秸秆还田配施钾肥对水稻产量与钾素吸收的影响[J]. 江苏农业科学，2021，49（2）：43-47.