朱玉华，朱 琳，刘文娟，刘绪同，魏可健

（深圳市金新农科技股份有限公司，广东 深圳 518107）

仔猪饲养是养猪生产中的关键环节，断奶后仔猪腹泻是危害仔猪生产最重要的疾病之一，严重影响仔猪后期生长发育和养殖效益。在饲料中添加高剂量氧化锌和抗生素是防止肠道感染、防治断奶仔猪腹泻和抗病促生长的传统手段。随着滥用抗生素带来的细菌耐药性增强、药物残留引起食品安全等问题日益突出，根据农业农村部第194号公告，2020 年7 月1 日起，已全面禁止饲料中促生长类药物饲料添加剂使用。一些栏舍条件、养殖技术较差的用户可能无法适应无抗饲料，另外替抗技术不可避免会增加一定的成本，因此研发高效低成本的抗生素替代产品、降低无抗饲料成本、保障养殖效益依然是研究的重点。益生菌、微生态制剂及抗菌肽等具有调节肠道菌群、抑制有害微生物生长、促进猪只采食和生长、提高机体免疫机能等特点，作为新型抗生素替代品具有良好的应用前景。

1 断奶仔猪肠道健康研究现状

肠道黏膜屏障结构和功能的完整性是其发挥消化、吸收和免疫防御等生理功能的基础，断奶应激引起的肠道菌群紊乱和屏障损伤是导致仔猪腹泻、生长受阻甚至死亡的重要原因。仔猪断奶时会受到饲料改变、心理应激和环境应激等3 方面因素的干扰［1］，进而造成肠道生理结构和功能、免疫功能及肠道菌群结构的改变。近年来，肠道菌群在仔猪腹泻发生中的作用受到越来越多的关注。由于全面禁止饲料中添加抗生素，以肠道菌群为靶点寻找新的绿色生物饲料和添加剂防治仔猪腹泻、促进仔猪肠道健康和生长，倡导绿色无抗养殖理念对于养猪生产和人类食品安全都至关重要［2］。微生态制剂以及发酵代谢物、酶制剂、抗菌肽、有机微量矿物质饲料添加剂等替代抗生素在添加剂预混合饲料中的应用也越来越广泛［3-7］。

仔猪在断奶窗口期生长发育及生理机能尚不完善，主要包括：消化系统发育和功能不完善、胃容积小且消化机能不足、免疫系统发育和功能不完善。断奶意味着仔猪的胃肠生理、微生物及免疫发生着巨大的变化。断奶后由于日粮形态改变造成消化道pH升高，有益菌如乳酸菌及双歧杆菌等含量下降，有害菌如大肠杆菌等大量繁殖、释放毒素，引发菌群平衡失调［8］。在此基础上原发或继发肠道屏障损伤、上皮细胞形态和功能改变，肠绒毛高度降低、隐窝深度增加等，致使仔猪消化吸收功能进一步受损［9］，而仔猪自身免疫系统发育尚不完善［10］，抗病力差，极易出现生长停滞、精神萎靡、腹泻等断奶应激综合征。肠道结构和功能的损伤，会极大减少肠道分泌型免疫球蛋白A（Secretory immunoglobulin A，sIgA），直接黏附肠道黏膜的有害菌增加、释放毒素，形成肠道损伤的恶性循环［11］。此外，大量研究表明，断奶仔猪体内磷酸化酶活性降低，糖异生能力较差，碳水化合物等能源物质的利用受限，体脂沉积减少，对氨基酸的代谢可能存在缺陷［12-19］。断奶仔猪的生理特点以及断奶应激、仔猪腹泻对生产效率的影响现状，决定了对饲料品质、功能和饲喂方式等的特殊要求。

2 微生态制剂在饲料养猪生产中的应用

微生态制剂是指采用正常微生物活菌或促进微生物生长的物质制成的生物制剂，一切能促进机体正常微生物生长或抑制致病菌生长繁殖的均可称为微生态制剂。近年来，已研究出含菌体组分及其代谢产物死菌的产品。按照所包含的菌种类型，可将微生态制剂分为乳酸菌类、酵母菌类和芽孢杆菌类；按其所含菌种的数量和菌种组合工艺，可分为单一菌种和复合菌种微生态制剂。结合固态和液态微生物发酵工艺以及饲料营养等专业技术，微生态制剂已形成种类繁多、应用广泛的一类产品。

2.1 微生态制剂在养猪生产中的应用和作用机制

微生态制剂具有促进动物肠道有益菌定植、维持机体微生物区系平衡、促进营养物质的消化和吸收及增强机体的免疫功能等优点。在畜牧养殖生产中，益生菌制剂本身含有丰富的营养物质，具有调节肠胃微生态平衡的功效，且无毒无污染，不产生细菌耐药性，可减缓幼龄动物断奶应激等而备受人们的青睐［20］。已有研究发现，在猪日粮中添加复合微生态制剂可达到提高断奶仔猪生长速度、防治腹泻及母猪便秘等作用［21］。

结合微生态制剂在畜禽养殖生产中的应用，其具有以下作用效果。

2.1.1 营养作用 通过微生物发酵及饲料营养等进行合理设计，可改善饲料风味，提高纤维、小肽等营养物质的消化吸收，提高饲料利用率；同时益生菌代谢可产生各类消化酶、有机酸和一些未知生长因子，例如芽孢杆菌可产生蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶等，利于饲料营养物质的进一步降解从而更易于动物机体消化吸收；此外，菌体蛋白可被动物宿主消化吸收，如酵母菌可作为优质的单细胞蛋白原料，富含蛋白质、氨基酸和多糖，可提高饲料的适口性，进而提高动物采食量，促进动物生长性能并能够增强机体免疫功能［22］。微生物和宿主之间进行的营养物质、能量和基因的交换，被称为“三流循环学说”，即宿主为机体内微生物提供其生长所需要的营养物质和能量，微生物再通过自身的合成、代谢和降解，对宿主体内的营养物质进行再加工，实现循环。

2.1.2 去除饲料中抗营养因子 通过微生物发酵去除豆粕中的大豆抗原蛋白、棉粕中的游离棉酚等，有助于植物蛋白原料在幼龄动物阶段的应用。研究表明，地衣芽孢杆菌等对霉菌毒素呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等具有良好的降解作用；在当前饲料成本居高不下、人畜争粮等大背景下，通过微生态制剂及发酵技术提高非常规原料的消化吸收及利用、去除抗营养因子，改善原料加工特性及提高适口性等方面具有很好的发展前景。

2.1.3 提高机体免疫力 大量研究表明，益生菌对动物机体具有重要的免疫调节作用，可通过调节肠道菌群区系平衡、刺激免疫物质的活性、调节免疫应答等多种途径，加强动物机体的免疫力［15］，而且在抗菌、抗病毒及抗霉菌毒素方面效果显著。此外，微生态制剂中死菌及代谢产物也具有一定的调节肠道微生物区系的作用，益生菌具有减少肠道细胞氧化损伤及发挥抗氧化功能等作用［23］。

2.1.4 抑制病原菌黏附 肠道菌群具有对外来病原微生物的定殖抗力，而益生菌进入机体肠道，可与病原体竞争肠道黏膜上有限的附殖位点，达到抵御病原微生物和条件性致病菌定殖的作用，从而保证机体健康。其作用机制主要为优势菌群理论，即健康动物机体肠道内的有益菌群属于厌氧菌，具有耐酸的特性，而肠道中有害菌大部分是需氧型菌群且不耐酸［24］，乳酸菌进入动物机体肠道中可通过黏附肠黏膜进行定殖，大量定殖的乳酸菌进一步降低肠道环境的pH，达到抑制有害菌生长和定殖的作用，从而维持肠道菌群平衡和肠黏膜屏障功能［25］。

2.2 微生态制剂在养猪生产应用中存在的问题

微生态制剂具有无毒、无残留、无耐药性及可有效补充消化道内有益微生物等诸多优点，在断奶仔猪中应用可有效缓解仔猪断奶应激和腹泻情况［26］，提高动物机体生长性能等［27］。微生态制剂不但能提高畜产品质量，还能减少环境污染，但其应用效果受多方面因素的限制。目前我国从事微生态制剂的企业有上千家，市场上微生态制剂产品中菌株种类和含量不同，缺乏统一的产品规范和质量标准且市场推广普及率较低，是限制微生态制剂产业规模的重要瓶颈。乳酸杆菌等益生菌在益生作用方面具有较好的应用潜力，然而其抗逆性差，受生产工艺、储存运输、饲喂方式和剂量等条件的影响，导致益生菌的活性严重降低，进入动物肠道后仍存活的益生菌种类和数量大大减少。随着微生物研究和动物肠道健康调控观念的普及，各类微生态制剂产品不断涌出，普遍存在菌种来源不明、菌种搭配盲目组合、大规模发酵产品质量稳定性差、多菌种混合发酵代谢过程不清晰、产品质量评价体系缺失等问题，极大地限制了益生菌等微生态制剂的应用效果。

3 动物肠道微生物研究概述

了解动物肠道微生态功能，掌握微生态对动物肠道健康的调控作用及机制，是进一步发挥微生态制剂应用效果的关键。在正常的生理状态下机体肠道内的细菌无论在菌种还是在数量上均保持着动态的平衡，称为肠道微生态平衡［28］。肠道菌群自宿主出生后便开始定殖，环境因素、饮食习惯、生活方式均可以影响肠道菌群与宿主之间的动态平衡，这种动态平衡的维持对机体生长发育、消化吸收、免疫功能等均具有重要意义。益生菌及其共生菌在肠道黏膜形成的菌膜具有十分重要的作用，不同特性的微生物族群形成优势菌群和酸性厌氧环境，共同形成相对稳定的菌膜结构和生物屏障，形成肠道黏膜定殖抗力，可有效降低有害菌黏附、抵御有害菌及条件性致病菌等对机体的侵袭［29］。

3.1 肠道微生物与机体健康调控

肠道微生物参与构成机体肠道黏膜物理屏障、化学屏障和生物屏障，是机体肠黏膜屏障重要的组成部分，同时免疫激活作用产生IgA 和IgM 及各种免疫活性细胞和细胞因子等，有助于动物早期免疫屏障的建立［30］。肠道微生物具有促进宿主营养物质代谢，自身也可以代谢产生多种维生素、非必需氨基酸等，为自身提供养料的同时也为宿主提供了养分。肠道微生物可分解动物本身难以消化利用的植物性原料如纤维素、半纤维素等，产生短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）。SCFAs 是后肠黏膜细胞的主要能源来源，其中乙酸、丙酸和丁酸含量最为丰富，肠细胞发挥生理功能所需约60%～70%的能量来自于丁酸，对促进肠黏膜上皮细胞的生长及生理功能的发挥具有重要作用。SCFAs作为重要的信号因子参与信号通路调节机体代谢，可通过激活SCFAs受体、释放肠激素肽等影响肠胃蠕动，SCFAs 还可影响胃肠道黏液的分泌，维持肠黏膜上皮结构的完整，促进肠道健康［31］。

肠道菌群另一重要作用为调节机体代谢和免疫系统功能，在动物出生时机体内是无菌的，通过正常菌群的生长逐步刺激机体免疫球蛋白的分泌和释放，促进免疫系统的发育和成熟，逐步构建机体正常的免疫机能。同时，肠道免疫系统持续性地调节宿主对病原菌的耐受性，调节肠道菌群的稳态，二者相辅相成［32］。肠道微生物被认为是宿主主要的抗原来源物，如双歧杆菌、干酪乳杆菌等可刺激肠黏膜细胞分泌sIgA，sIgA 是肠黏膜免疫的主要效应因子，可有效中和黏膜上皮内的病原体，激活肠黏膜免疫细胞因子与免疫应答等［32］。无菌动物是研究微生物的重要工具模型，无菌小鼠的潘氏结发育程度低，仅有极少的淋巴细胞和生发中心，在给无菌小鼠喂服双歧杆菌后，随着双歧杆菌在体内定殖，小鼠潘氏结内淋巴滤泡大量增生，产生sIgA数量增加，肠道黏膜屏障和免疫功能趋于成熟，表明肠道菌群的建立、定殖和成熟，对机体免疫系统的启动、发育成熟有着极其重要的作用［33］。肠道菌群对机体非特异性免疫和特异性免疫均有调控作用，共同形成肠道内第一道免疫屏障［34］。

3.2 肠道微生物研究在畜禽生产中的应用

动物肠道健康是保障动物正常生长发育的前提。随着畜牧业实现现代化，健康养殖理念越来越多地受到关注，而动物肠道健康是健康养殖的关键。饲料中禁止添加抗生素后，如何维持或增强畜禽健康就成为目前研究的重点，尤其是畜禽早期的肠道健康［35］。幼龄动物肠道发育不健全，尚未建立稳定的肠道微生物群，免疫功能发育不完全，肠道微生态平衡稳定性非常脆弱，易受到各种因素如断奶、环境、抗生素等的影响，导致严重的肠道微生态紊乱［36］。帮助幼龄动物逐步建立肠道菌群稳态可刺激幼龄动物肠黏膜免疫器官的发育，增强机体免疫功能，抵抗外来病原菌的侵入，进而促进肠道健康和动物生长发育［37］。

在养猪生产中，出生和断奶是仔猪生长过程中最关键的2 个节点，初生仔猪肠道的形态结构不完善，消化吸收机能不健全，易受外界因素的干扰；断奶窗口期仔猪遭受内外应激时会引发腹泻［38，39］。腹泻是涉及肠道菌群、肠道免疫生理功能、食物改变、感染等多因素的综合性问题，利用整体的调控技术才能有效改善腹泻。早期菌群干预对新生仔猪肠道菌群快速定殖、肠道免疫系统的发育及对断奶仔猪肠道菌群的恢复均具有重要作用。因此，通过营养手段调控仔猪肠道菌群健康和免疫系统发育，可有效促进仔猪肠道健康。

4 基因工程生物制剂的应用与发展前景

基因工程技术是目前生物技术应用的重要组成部分，构建重组基因工程菌表达外源目的产物是获取新生物制品的有效途径，基因工程技术和发酵工程技术的有机结合，使许多非自然存在的外源蛋白或多肽得以规模化、低成本地生产。用于外源基因表达的系统主要有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等。其中微生物表达系统主要有大肠杆菌、酵母和芽孢杆菌系统，因其生长周期短、培养密度大和蛋白质产量高等优点被广泛应用，是目前主要的外源蛋白表达系统［40］。大肠杆菌（Escherichia coli）是目前最为成熟的表达系统，具有生长速度快、易于培养等优点。但是大肠杆菌在表达外源基因时存在蛋白加工不成熟的问题，如使酶蛋白不能发生糖基化修饰而活性较低，另外表达的重组蛋白多以包涵体的形式存在难以分泌到胞外，无法行使其正常的生理功能。酵母表达系统主要有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等［41］。酿酒酵母具有繁殖速度快、表达水平高及可以进行蛋白加工和修饰等优点，但其分泌效果差、表达的蛋白易无活性、表达菌株不稳定及糖基化程度过高等缺点也限制了其应用范围。

目前基因工程菌及其表达产物多停留在实验室小试阶段，鲜有生产应用的报道。常规发酵工艺表达效率较低、后期纯化成本高，且发酵后得到的重组产品稳定性评估少见报道，重组蛋白质丧失活性或其通过消化道容易被所分泌的酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等所降解，这仍是一个急需解决的技术难题。因此，迫切需要优化重组基因工程菌表达体系和发酵工艺。通过高密度发酵制备重组酵母菌生物制剂，大幅提高目的蛋白的产出率和产品质量，降低生产成本，评定其在生产上的应用效果，为其作为一种新的饲料添加剂积累资料，也为饲用抗生素的替代提供了一条新的解决途径。此外，基因工程疫苗的佐剂等也是科学研究与产业化应用的重要方向。

5 小结

随着抗生素滥用，畜禽生物安全、环境污染和食品安全问题日趋严峻，倡导绿色无抗养殖理念对于养猪生产和人类食品安全都至关重要。断奶仔猪腹泻对养猪业造成巨大经济损失，其发病涉及肠道菌群、肠道生理、免疫功能、营养状况及感染等多种因素，其中肠道菌群对仔猪腹泻发挥着极其重要的作用，以肠道菌群为靶点寻找新的绿色生物饲料和添加剂防治仔猪腹泻、促进仔猪肠道健康和生长是目前研究的重要方向。通过研究不同益生菌、代谢产物及其组合物的生物学功能和作用机制，有助于开发促进猪只生长、提高机体免疫力，调控肠道菌群、替代抗生素的高效安全的一系列新型生物制剂。了解正常菌群和动物免疫的相互关系，研制促进菌群平衡和机体免疫机能的微生态制剂或其他添加剂产品，对于养猪生产中减少抗生素使用、提高猪只生长和机体免疫力、促进绿色安全高效的健康养殖具有重要意义。

在非洲猪瘟疫情的常态化背景下，提高猪只免疫力、促进猪群健康是防控非瘟的重要环节。集约化养殖使疾病容易交叉感染，细菌耐药性日趋严重，多种病原的混合感染愈发普遍等是当前规模化养殖主要存在的问题，免疫减弱和抑制是动物感染和死亡的主要原因。在饲料中增加一些功能性添加剂产品，不仅能促进肠道消化吸收、增进肠道健康、提高机体免疫功能，还具有减少抗菌保健用药、改善养殖环境、降低腹泻、降低氨气含量等作用；饲料微生物技术和发酵技术已成为解决原料紧缺、替代饲用抗生素的关键技术，对于健康养殖、食品安全、环保减排等均有积极作用。目前国内微生物饲料添加剂的市场容量在180亿～200亿元，市场推广普及率仅为约10%，前景十分广阔，但也存在基础技术积累薄弱、菌种种类与性能单一、加工工艺粗放、产品质量与功效参差不齐等现象。微生态生物制剂未来发展趋势在于：①筛选更多具有直接促生长作用的优良微生物，利用生物工程技术改造菌群遗传基因，选育优良菌种，使其具有抗酸、抗热等能力。②加强微生物饲料添加剂菌体浓缩、稳定工艺及菌体剂型的研究，提高活菌浓度及其对不良环境的耐受力，以提高生产效率及产品稳定性。③微生物饲料添加剂菌种及其代谢产物功能研究，以筛选高酶活、产酸能力强、抑制病原菌能力强、抗逆性强、生产性能高的菌株，复合菌体现协同、叠加和附加值效应，并且需要重视动物消化道生理变化与微生态区系平衡。