高 嵩，孙文松，温 健，李晓丽，杨正书，李 玲

（1.辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳111000；2.辽宁省农业科学院 药用植物研究所，辽宁 辽阳111000）

龙胆（Gentiana scabra Bge．）为龙胆科多年生草本植物，是我国传统常用中药材，其应用历史悠久。龙胆以根际根茎入药[1]。 味苦，性寒。 归肝、胆经。 有清热燥湿，泻肝胆实火的作用。 主治湿热黄疸、阴肿阴痒、带下、湿疹瘙痒、肝火目赤，耳鸣耳聋，肋痛口苦，强中，惊风抽搐等症。辽宁省抚顺市清原县龙胆栽培基地种植龙胆草面积达2466hm2，年产量1600t，占全国市场份额的82%[2]。然而，基地近年来由于连作障碍，导致药用植物长势变弱，品质变差，生长期易患斑枯病、根腐病，严重连作障碍甚至会造成绝收[3]。

土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成部分，被认为是土壤质量不可缺少的组成部分，作物连作打破了根际土壤微生物生态平衡，进而导致有益微生物减少和病原微生物的积累。 药用植物生产中普遍存在连作障碍[4]，这不仅降低了药用植物的产量和品质，还影响临床用药安全[5]。 药用植物的连作障碍是很多因子综合作用的结果，近年研究提出中药材连作障碍的原因主要有土壤养分失调和理化性质劣变、土壤传染性病虫害加重、根系分泌物和残茬分解物等[6]，研究土壤微生物群落结构对于阐明药用植物连作障碍的发生机制具有重要作用，深入研究连作障碍的发生机制及其调控技术是龙胆草等药用植物生产中亟待解决的问题。

新一代高通量测序技术的发展解决研究土壤微生物分离培养效率低的瓶颈，根际微生物和连作障碍之间的关系再次成为研究的热点。 近年来，土壤细菌相关研究开始由结构向功能转变。 各国学者共同致力于土壤细菌功能预测与分析，并试图通过土壤细菌功能研究，揭示土壤细菌在陆地生态系统过程中发挥的重要作用[7]。16S rRNA 高通量测序可以通过PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）软件预测基因序列对应的细菌菌群代谢功能谱[8]。 PICRUSt 功能预测分析相较于宏基因组研究更加方便且成本也更低，同时预测效果具有较高的可靠性。目前该方法已在土壤环境中得到良好的应用[9-10]，而关于连作对药用植物土壤微生物的研究还未见报道。 本研究采用Illumina Miseq 高通量测序技术，以清原县椽子沟村不同年限连作龙胆草根际土壤为研究对象，分析了不同年限龙胆草根际土壤样品的细菌种群丰度和多样性的变化，并对细菌功能进行初步预测，试图探索龙胆草连作障碍与土壤根际细菌之间的关系，以期了解龙胆草连作对根际土壤细菌菌群多样性的影响，探究药用植物连作障碍机制，旨在从龙胆草根际土壤微生物方面入手为药用植物的生产实践和可持续种植提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

研究地点位于辽宁省抚顺市清原县椽子沟村（N125．06737，E42．08934），龙胆草属同一驯化栽培品系，试验采集种植龙胆草1 年（R1）、连续种植龙胆草2 年（R2）和连续种植龙胆草3 年（R3）的土壤，以距离采龙胆草样品约50m 未种过龙胆草的土壤作为对照（CK）。根际土壤取样采用“抖根法”：先将植物根系从土壤中挖出，抖掉与根系结合松散的土壤，再用毛刷轻轻刷下根系表面土壤，按“S”形采样方法，随机选取5 个点混合样品。 冰盒保存运回实验室，立即过20 目筛，保存于-80℃用于土壤细菌多样性检测。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA 的提取和PCR 扩增 采用CTAB 或SDS 方法对样本的基因组DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样本DNA 于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng·μL-1。 以稀释后的基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode 的特异引物，New England Biolabs 公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。16SV4 区引物（515F 和806R）用于鉴定细菌多样性；PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR 产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。 产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific 公司GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。

1.2.2 高通量测序 使用Thermo fisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher 的Ion S5TMXL 进行上机测序。

1.3 数据分析方法

1.3.1 测序数据处理和OUT聚类分析使用Cutadapt （V1．9．1, http://cutadapt．readthedocs．io/en/stable/）[11]对reads 进行低质量部分剪切，再根据Barcode 从得到的reads 中拆分出各样品数据，截去Barcode 和引物序列初步质控得到原始数据（Raw reads）经过以上处理后得到的Reads 需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads 序列通过（https://github．com/torognes/vsearch/）与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（Clean reads）。

1.3.2 菌群组成分析和差异分析 使用Qiime 软件（Version 1．9．1）计算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，Ace，Goods-coverage 等指数，使用R 软件（Version 2．15．3）绘制稀释曲线，Rank abundance 曲线，物种累积曲线并使用R 软件进行Alpha 多样性指数组间差异分析。 对OTUs 进行多序列比对，通过样本聚类热图展示，探究不同样本和组别间群落结构的差异。 序列文件上传到Galaxy 网站进行PICRUSt 功能基因预测分析，得到土壤细菌功能基因组成。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤样本测序结果及质量控制

表1 为10 个不同处理土壤样本序列数据统计表，高通量测序共获得801346 条有效序列，运用QIIME 软件剔除序列长度＜150 bp 的序列和5′端引物错配碱基数＞1 的序列以及含有连续相同碱基数＞8 的序列，经过剔除嵌合体序列处理。 按照优化标准，去除不合格序列后共得到有效序列（Clean reads）801346 条，每个样本有效序列占原始序列的平均有效率为95．55%， 最低为91．98%。对所有样品的全部Clean reads 进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs， 同时筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs 的代表序列． 对OTUs序列进行物种注释，用Qiime 软件（Version 1．9．1）中的blast 方法（http://qiime．org/scripts/assign_taxonomy．html）与Unit(v7．2)数据库（https://unite．ut．ee/）进行物种注释分析。

由图1 可知，当测序量超过10000 读长时，虽仍有新的OUTs 出现，但由于曲线已趋于平缓，表明该样品取样基本合理，在真实的环境中细菌群落结构的置信度较高，能够比较真实地反映土壤细菌群落多样性，即当前测序深度足以反映该群落样本所包含的细菌群落多样性。

表1 不同处理样本序列数据统计Table 1 Statistics of sample sequences data

图1 龙胆草根际土壤细菌高通量测序结果的稀释曲线Figure 1 The dilution curves of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.2 不同处理土壤细菌群落丰富度和多样性的统计分析

由表2 可知，各样品文库的覆盖率均大于99．3%，说明各样地的微生物物种信息得到了充分的体现，本次测序结果能够代表清原县龙胆草土壤细菌群落的真实情况。 与种植1 年龙胆草根际土壤细菌群落丰富度指数Chao1、多样性指数Shannon、样品覆盖率Coverage 相比， 种植2 年、3 年根际土壤群落丰度和多样性呈逐年下降趋势，种植3 年根际土壤细菌丰度和多样性大幅度降低，这与大部分研究结果一致。 说明细菌物种丰富度减少可能是导致龙胆草连作障碍的原因之一。

2.3 土壤细菌群落结构分析

根据物种注释结果，10 个龙胆草土壤样品的5140 个OTUs 分属于36 门51 纲112 目218 科470 属。 由图2 可知，不同年限龙胆草根际土壤的最主要类群，各土壤样品间的细菌群落组成相似，除了未确定种属的其他菌类，相对丰度较高的前10 个菌门分别为放线菌门（Actinobacteria）、变 形 菌 门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi ）、厚 壁 菌 门（Firmicutes）、拟 杆 菌 门（Bacteroidetes）、浮 霉 菌 门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和奇古菌（Thaumarchaeota）。 由图1 可知，变形菌门、放线菌门和酸杆菌门是龙胆草土壤的优势菌群，3 个门约占总群落的75%。且各样地土壤样品的相对丰度之间存在差异。 与对照土壤相比，细菌的差异种类减少，说明连作影响土壤细菌群落的多样性。

表2 龙胆草根际土壤细菌群落丰富度及多样性指数Table 2 The species richness and diversity index of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

由 图3 可 知，γ-变 形 菌 纲 （Gammaproteobacteria）、α-变 形 菌 纲 （Alphaproteobacteria）、 放 线 菌 纲（unidentified_Actinobacteria）、Thermoleophilia、Acidobacteriia、unidentified_Gemmatimonadetes、Δ - 变 形 菌 纲（Deltaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）和unidentified_Acidobacteria 等组成土壤细菌群落。 第一优势菌纲显著差异，除其他外，对照组的优势菌纲为Thermoleophilia（18．56%）＞α-变形菌纲Alphaproteobacteria（15．91%）＞unidentified_Actinobacteria（11．93%）。 而1 年生龙胆草土壤细菌的优势菌纲为α-变形菌纲（24．45%）＞γ-变形菌纲 （15．17%）＞Acidobacteriia （9．75,%）；2年生龙胆草土壤细菌的优势菌纲为α-变形菌纲 （17．78%）＞Thermoleophilia （16．23%）＞unidentified_Actinobacteria （16．02%）；3年生龙胆草土壤细菌的优势菌纲为unidentified_Actinobacteria（21．79%）＞α-变形菌纲（16．04%）＞γ-变形菌纲（14．41%）。 随种植年限增加，优势菌群unidentified_Actinobacteria、Acidobacteriia 和unidentified_Gemmatimonadetes 芽孢杆菌纲含量显著增加，α-变形菌纲、Δ-变形菌纲和unidentified_Acidobacteria 纲含量著减少。

图2 龙胆草根际土壤细菌门水平群落组成Figure 2 The phylum distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

图3 龙胆草根际土壤细菌纲水平群落组成Figure 3 The class distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.4 不同年限土壤菌群的分类学组成分析

表3 为龙胆草根际土壤细菌样品前10 名属及相对丰度。 进一步从属水平研究发现，不同生长阶段乃至不同样地之间的细菌群落丰度差异明显。 由表3 可知， 在属水平上， 对照组土壤菌群主要有Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和unidentified_Acidobacteria 等优势类群（＞2%）；而1 年生龙胆草土壤菌群主要有Sphingomonas、Burkholderiaceae_unidentified、Bradyrhizobium 和Bryobacter 等优势类群（＞2%）；2 年生龙胆草土壤菌群主要有unidentified_Burkholderiaceae、unidentified_Gaiellales、Acidothermus 和Sphingomonas等优势类群（＞2%）；3 年生龙胆草土壤菌群主要有Rhodanobacter、Acidothermus、Chujaibacter、 Sphingomonas、unidentified_Gaiellales 和unidentified_Burkholderiaceae。 通过比较可知，种植龙胆草的优势菌属共有7 属：Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Gaiellales_unidentified、 Burkholderiaceae_unidentified、 Pseudolabrys 和Bradyrhizobium，而与对照相比共有优势菌属只有Bradyrhizobium 一个属。 总的来说，一些优势菌属丰度变化不大。 随种植年限增加，Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Burkholderiaceae_unidentified、Pseudolabrys 等属丰度呈上升趋势；而随种植年限增加，Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和Gaiella 等属丰度呈下降趋势。

表3 龙胆草根际土壤细菌群落在属水平上的分布Table 3 The dominant genus distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.5 菌群代谢功能预测

运用PICRUSt 软件通过将现有的群落组成数据与KEGG 数据库中微生物代谢功能的类别对比进行群落样本功能预测。 由图4 和图5 可知，龙胆草不同年限土壤中获得的一级功能层预测生物代谢功能通路分析相对丰度大于1%的功能基因包括6 种：遗传信息处理、细胞过程、人类疾病、环境信息处理、代谢和有机系统，每种功能基因在不同生境中相对丰度基本一致。同时对预测基因二级功能层进行分析，发现其由遗传信息处理、翻译、细胞生长与死亡、折叠、分类和降解、核苷酸代谢、信号转导、细胞运动等35 个子功能组成。随种植年限增加，行使代谢功能类别中编码能量代谢、维生素和辅助因子的代谢大量减少；疾病、外源生物降解与代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢、膜运输显著降低；转录、运输和分解代谢、环境适应、信号分子相互作用、酵素家族、复制和修复、细胞信号处理、不良特征功能基因增加，其中，转录、运输和分解代谢显著增加。 聚糖生物合成与代谢、内分泌系统、脂代谢、氨基酸代谢、免疫系统疾病、碳水化合物代谢的功能基因有少量增加。

图4 细菌群落样本的代谢一级功能预测图Figure 4 The prediction map of the metabolic function at hierarchy level 1 in community samples

3 讨论与结论

土壤微生物是地下生态系统中重要的生物因子，对农业生态系统的能量流动、物质循环及稳定性有重要作用[12]。受根系分泌物的影响，根际土壤微生物种类和数量具有强烈的根际效应[13]。越来越多的证据显示，根际土壤微生物的数量、种类、代谢活性及微生物间的相互作用决定着植物的健康状况[14]。大量研究结果表明，连作土壤的有益微生物量随土壤连作年限的增加而逐渐减少，而有害微生物量却逐渐增加[15-16]，为土壤传染性病害的传播和病原菌的寄生繁殖创造了条件，对块根类药材的根茎部位生长产生危害[17-19]。 研究发现人参根际土壤和非根际土壤微生物群落结构存在显著差异[20]，连作西洋参根际细菌和真菌多样性发生变化[21]。 本研究根际多样性分析表明，随着种植年限增加，根际土壤细菌丰富度和多样性指数呈逐年下降趋势，种植3 年细菌丰度和多样性大幅度降低。

土壤中微生物以细菌数量最多，占土壤微生物总量的70%以上，细菌群落中含有大量具有特殊功能的生理类群，如固氮菌、氨化细菌、硝化细菌等[22]。 细菌种类的变化， 会对这些特定生理类群的数量产生直接影响，从而影响土壤肥力。 本研究表明，连作影响根际土壤细菌的群落结构。 随种植年限增加， 优势菌群unidentified_Actinobacteria、Acidobacteriia 和unidentified_Gemmatimonadetes 芽孢杆菌纲Bacilli 纲含量显著增加，α-变形菌纲、Δ-变形菌纲和unidentified_Acidobacteria 纲含 量 显 著 减 少；Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Burkholderiaceae _unidentified、Pseudolabrys 等属丰度呈上升趋势；而随种植年限增加，Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和Gaiella 等属丰度呈下降趋势。土壤根际微生物群落结构的差异会表现在基因表达方面的差异，本研究发现，环境信息处理和代谢功能基因大量减少，而病害基因增加。 这与藜麦重茬根际土壤中编辑复制和修复以及外源性物质降解和代谢的功能基因大量减少的结果一致[23]。 最终导致细菌对外来入侵的抵抗能力减小，植物生长受阻，土传病害增加，产量急剧下降。

同时，本课题组其他研究发现，龙胆草连作不仅仅会导致有益细菌群落丰度降低，有益真菌的数量也会大幅度降低，而病原菌真菌的数量则会大幅度增加。 可能是由于连作打破了龙胆草根际土壤微生物之间的平衡，从而导致土壤细菌功能性紊乱，从而负反馈于植株本身，导致了龙胆草的连作障碍，但具体的作用机制和相互之间的关系还需要进一步研究。

连作障碍影响药用植物微生物多样性和群落结构的研究多集中在土壤微生物量的变化方面，对微生物功能的研究较少。 PICRUSt 分析通过与数据库比对，将微生物的变化情况和生物功能联系起来。 在呼伦贝尔沙区4 种典型生境的一级功能层中，细菌群落的功能特征影响细菌群落结构与多样性，沙地樟子松天然林中较高丰度的的代谢、遗传信息处理、有机系统3 类功能基因使土壤细菌代谢旺盛,生长力好，从而提高了细菌群落结构的多样性。 有研究发现施用多效唑后，土壤细菌的功能有一定的改变，在功能层预测基因拷贝数整体趋势低于对照组[24]。 连作障碍土壤微生物的相对丰度发生改变，其功能也发生相应的变化，本研究对高通量测序结果进行PICRUSt 功能预测分析，该结果初步揭示了不同年限龙胆草根际土壤细菌功能的差异，随种植年限增加，以转录、运输和分解代谢为代表的行使代谢功能类别中大量功能基因呈增加趋势；而外源生物降解与代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢、膜运输等功能显著降低。 但鉴于PICRUSt 功能预测分析的局限性，后续需要结合宏基因组测序等技术进一步分析。

本项研究在龙胆草的相关研究中尚属首次，能够全面地揭示许多利用传统生化技术研究土壤微生物无法解决的问题，结果中获得的土壤微生物多样性变化能够揭示龙胆草连作后土壤细菌种群多样性的变化，并且预测了根际土壤细菌种群代谢功能的变化，为今后研究其他药用植物连作障碍机制提供参考。 但本研究所采用的高通量测序技术的第2 代测序技术，对细菌的分类仅限于属的水平，无法定位到某一种细菌，且同一属的不同细菌种在土壤中可能会行使不同的功能，而不同属的细菌也可能在土壤中行使同样的功能，研究所得到的结果可能会有偏差。 而随着第3 代测序技术的进一步完善和发展，对根际微生物的研究将会更加全面和细化，今后仍有待开展更深层次的研究。

图5 细菌群落样本的代谢二级功能预测图Figure 5 The prediction map of the metabolic function at hierarchy level 2 in community samples