浅谈微生物菌种保藏方法

2021-03-17

轻工标准与质量 2021年1期

（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110036）

微生物菌种是我国非常重要的生物资源，也是我国自然资源宝库的重要组成部分，对生产和研究有着举足轻重的作用。随着微生物菌种被越来越多的应用到食品、饲料、医药等领域，其活性和稳定性显得越来越重要，因此对菌种保藏的要求也越来越高[1]。本文结合笔者多年一线食品微生物检验、食品安全风险监测阳性菌株鉴定、复核、分型及药敏试验等相关工作经验及相关文章文献，对常见微生物菌种保藏方法的优劣进行比较，以期为微生物检验或保藏机构提供参考。

1 菌种保藏基本原理

微生物菌种保藏的方法不少，原理也是相差无几，基本都是依据微生物的种类和繁殖的生理生化特性不同，通过对温度、湿度、氧气等条件的控制，达到微生物生长代谢活动受到抑制，生长繁殖暂时处于休眠的状态，既保证菌种不死、不衰、不变，又使其代谢处于最低状态，同时保持菌种本身应有的特性。好的保藏方法既要考虑方法的经济性，又要考虑到简便性，以利于在生产和工作中方便应用[2]。应根据不同菌种的特点以及需求，选择合适的保藏方法。

2 微生物菌种常用保藏方法

2.1 定期移植法[3]

此方法有时也称为传代培养法，该方法是一般微生物实验室经常使用的保藏方法之一（如图1、图2 所示）。根据不同微生物生长繁殖所需条件的不同，将需要保藏的菌种接种至适宜的斜面或者液体培养基中，在适当温度条件下培养至所需时间，生长充分以后，于4℃～6℃条件下保存，保藏时间一般为4 个月～6 个月，隔一段时间进行一次传代培养。应注意对于副溶血性弧菌等弧菌不可采用冷藏方法进行保藏。

图1 传代培养法

此方法的优点是操作不复杂，观察方便，且对人员要求不高，一般微生物从业人员均可顺利完成，是微生物检测的基础操作。基本不需要特殊仪器设备，成本较低，应用范围广。但缺点是工作强度大，无法保存较长时间，需要频繁进行传代移植，而且在移植过程中极易造成污染和菌种的退化。

图2 琼脂斜面保藏法

2.2 矿物油保藏法[4,5]

此方法有时也称为液体石蜡保藏法，是定期移植保藏法的辅助方法。通常将液体石蜡灭菌后封盖培养物表面，防止培养基水分蒸发的同时也起到隔绝空气的作用来抑制微生物的生长繁殖，使其处于休眠状态。应注意在保藏中要定期进行检查，确保液面始终高于培养基。

此方法的优点是保存时间相对较长，可达到2 年～10 年，并且操作简单，使用方便，对于很多真菌的保藏也适用。但缺点是对人员操作水平有一定要求，且操作强度大，成本高。在使用矿物油时要注意防止污染和防范火灾，且直立的试管需要对存放空间有较高要求，携带十分不便。

2.3 真空冷冻干燥保藏法[6,7]

此方法是指将需要保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经过真空封存后进行保存的保藏方法。此方法可克服简单保藏方法的不足。可充分利用对菌种保藏的有利因素，使微生物菌种始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是时至今日最有效的菌种保藏法之一。此方法的原理是将冷冻的培养物在减压状态下进行真空干燥，使菌种处于不利于其生长繁殖的环境。对于好氧菌和厌氧菌的保藏，主要操作程序基本相同，但需要注意保护剂的选择。

此方法的优点是保存期限长，可达到10 年以上，且携带、运输方便，菌种的存活率和稳定性均较高。缺点是对设备要求高，需要专业的冷冻真空干燥设备，投入相对较高；对人员操作水平要求高，操作方法相对繁琐，通常专业化的菌种保藏机构选用此种方法；冷冻干燥过程对菌体有一定损伤，需进行恢复培养。

2.4 载体保藏法[6,8]

此方法又称为干燥保藏法。一般会依据选择载体的不同，最常采用沙土管、明胶片、滤纸保藏法。对于产孢子或有芽孢的霉菌和放线菌都可以用这种方法进行保藏。

此方法的优点是操作简便，所需仪器设备简单，而且便于携带。缺点是对营养细胞不适用，使用范围相对较窄。

2.5 液氮冷冻保藏法[9]

此方法有时也称为液氮超低温冻结保藏法。将悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移至-196℃的液氮或-150℃的液氮气相中保存的方法。方法要求配备一些专用设备，如液氮冰箱、液氮储藏器等，需要使用甘油、吐温80 等保护剂。此方法适用于支原体、衣原体等采用冷冻干燥法难以保藏的菌种，是很多菌种保藏机构选择较多的方法。

此方法优点是菌种保藏时间较长，菌种存活率高，且不易发生变异及退化。但缺点是操作相对复杂，对人员操作水平要求高；设备昂贵，需要定期补充液氮，保藏成本高。同时需注意防爆危险的发生。