何振辉，蔡坤泰，翁闪凡 *，林 鹏，魏 琼

（1. 佛山科学技术学院 医学检验系，广东 佛山528000；2. 佛山科学技术学院附属口腔医院佛山市口腔医院，广东佛山528000；3. 佛山科学技术学院 口腔医学系，广东 佛山528000；4. 佛山市南海区第五人民医院 检验科，广东 佛山528231）

大黄素（1，3，8-三羟基-8-甲基蒽醌）是何首乌、大黄等中药提取的蒽醌类单一有效成分，是芦荟大黄素（Aloe Emodin，AE）的同分异构体，Emo 结构式见参考文献［1］。Emo 具有广泛的药理学作用，包括致泻、抗菌、降血压、抗肿瘤等。Emo 具有诱导和抑制肿瘤细胞凋亡的双重作用［2］。但Emo 对鼠源性肿瘤细胞B16F10 转移潜能的影响，未见文献报道。本文以体内和体外模型研究了Emo 对B16F10 细胞转移相关能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

鼠源性黑色素瘤细胞B16F10 由岭南转化医学研究中心严爱芬副教授惠赠。细胞在RPMI-1640 完全培养基（5%胎牛血清，100 mg/L 青霉素和链霉素）中于37 ℃、5%CO2、饱和湿度孵箱培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.1.2 实验动物

C57BL/6 小鼠，雌雄并用，体质量18～20 g，由广东医科大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-008）。动物饲养和实验符合相关动物伦理规定。

1.1.3 主要试剂和药品

主要试剂与药品的来源如表1 所示。

表1 主要试剂与药品来源

本实验以DMSO 溶解Emo，作用细胞前以培养基稀释，DMSO 终浓度≤0.1%（V/V）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞生长抑制实验

细胞生长抑制实验步骤为：于96 孔细胞培养板中接种对数生长期的B16F10 细胞，每孔为5×104，待细胞贴壁生长过夜。将Emo 以培养基稀释加入各孔中，设立PBS 和0.1%DMSO 的对照组，继续培养6 h 后每孔加入浓度为2.5 mg/mL 的MTT 20 μL，再继续培养4 h，吸去培养基后每孔加入200 μL 二甲基亚砜（DMSO），将96 孔细胞培养板在摇床上振摇30 min。在酶标仪上检测570 nm 的吸光度。每个药物浓度设置8 个平行孔，实验重复3 次。细胞生长抑制率的计算公式为

1.2.2 基质粘附能力实验

基质粘附能力实验步骤为［3-4］：以Emo 处理B16F10 细胞24 h，并以胰酶消化后加入到96 孔板中（1×105/孔，3 复孔）。孔中预先包被有FN/VN 10 μg，37 ℃温育2 h，以PBS 冲洗3 遍去除未粘附细胞。以PBS、0.1%DMSO 处理的细胞作为对照组。粘附细胞的数量以MTT 法测出，结果以A570表示。其粘附抑制率的计算公式为

1.2.3 Matrigel 侵袭实验

Matrigel 侵袭实验步骤为：收集对数生长期的B16F10 细胞，重悬于含0.1%小牛血清（BSA）的1640培养基，加至Transwell 小室中（每室1×105细胞），同时加入PBS 和各浓度的药物。Transwell 小室中的PVPF 膜（带有小孔的滤膜，小孔内径为8 μm）上表面均匀涂抹Matrigel 50 μg，下表面均匀涂抹FN 10 μg。将Transwell 小室放入24 孔板中，在小孔中加入600 μL RPMI-1640 完全培养基。6 h 后将Transwell 小室取出，以苏木素-伊红染色后计数下表面的穿膜细胞，每个小室取5 个随机视野计数，实验重复3 次。其抑制率的计算公式为

1.2.4 划痕实验

划痕实验［5］步骤为：5×105细胞接种于直径为35 mm 塑料碟子中，待细胞在完全培养基中生长至80%融合度，以无菌的tip 头造成平行的约400 nm 的伤口，用PBS 冲洗伤口后，在细胞碟中加入含药的培养基，24 h 后观察划痕中细胞的覆盖度，以划痕中细胞数量相对于对照组的百分比表示。

1.2.5 测定肿瘤细胞粘附肺组织

调整对数生长的B16F10 细胞浓度为1×107/mL，以1 000∶1 的比例（体积比）加入5 mmol/L 的CFSE，37 ℃水浴10 min，在此期间摇动2～3 次，在1 mL 加有CFSE 的细胞悬液中加入2 mL 预冷的小牛血清，充分混匀，1 000 r/min 离心5 min，用PBS 洗涤细胞两遍。以不同浓度Emo 处理CFSE 标记的B16F10 细胞24 h，收集细胞，将5×105的B16F10 细胞于d0 通过尾静脉接种于C57BL/6 小鼠（n=8）。然后在d15 处死小鼠，剥离小鼠肺，制作冰冻切片，并在荧光显微镜下计数随机20 个视野的绿色荧光斑点数量。

1.2.6 Emo 对乳腺癌实验性转移的影响

5×105的B16F10 细胞（先以不同浓度的Emo 处理24 h）于d0 通过尾静脉接种于C57BL/6 小鼠（n=8）。然后在d15 处死小鼠，剥离内脏器官，计算其表面的转移结节的数量。

1.2.7 统计学分析

2 结果

2.1 Emo 对B16F10 细胞存活的影响

根据MTT 实验的结果，为了排除药物对细胞杀伤作用的影响，选择10、20、40 μmol/L 为体外侵袭重组基底膜实验Emo 的作用浓度。40 μmol/L 及以下浓度的Emo 处理B16F10 细胞6 h，吸光度A570与空白对照组相比，差别无统计学意义（P＞0.05）。当药物浓度达到80 μmol/L，6 h 处理后A570与空白对照组相比，差别有统计学意义（P<0.05）。结果如表2 所示。

表2 Emo 对B16F10 细胞增殖的抑制作用（x±s，n=3）

2.2 Emo 对B16F10 细胞体外粘附能力的影响

与空白对照组相比，Emo 处理后粘附VN、FN 的B16F10 细胞数明显降低，表现为MTT 法测出的A570明显下降。40 μmol/L 的Emo 获得最大的粘附抑制率，超过30%。结果如表3、4 所示。

表3 Emo 对B16F10 细胞粘附VN 能力的影响（x±s，n=3）

表4 Emo 对B16F10 细胞粘附FN 能力的影响（x±s，n=3）

2.3 Emo 对B16F10 细胞侵袭重组基底膜能力的影响

各浓度Emo（10、20、40 μmol/L）作用B16F10 细胞6 h 后，粘附在PVPF 膜下表面的细胞数明显减少，40 μmol/L 处理时最大抑制率达到（41.65±6.37）%，如表5 及图1a、1b 所示。

表5 Emo 对B16F10 细胞侵袭能力的影响（x±s，n=3）

图1 粘附于PVPF 膜上的B16F10 细胞

2.4 Emo 对B16F10 细胞迁移能力的影响

与空白对照组相比，各浓度Emo（10、20、40 μmol/L）处理的B16F10 细胞在伤口内数量明显减少，因而占空白对照组的百分比明显降低，表明细胞运动能力显著下降，结果如图2 所示。

2.5 Emo 对B16F10 细胞粘附肺组织的影响

采用CFSE 标记技术可以检测循环肿瘤细胞对体内器官和组织的粘附。CFSE 标记的B16F10 细胞接种C57BL/6 小鼠24 h 后，取肺组织制作冷冻切片。结果表明，Emo 处理的B16F10 细胞在肺组织切片中形成荧光斑点数明显减少，如图3 所示。

2.6 Emo 对B16F10 实验性转移的影响

B16F10 细胞仅在C57BL/6 小鼠内脏器官中的肺表面形成肉眼可见的黑色转移结节，与空白对照组相比，Emo 处理的B16F10 细胞形成转移结节的数量明显减少，如图4 所示。

图2 大黄素抑制B16F10 细胞运动能力(x±s，n=3)

图3 大黄素对小鼠肺部组织切片荧光斑点数量的影响（x±s，n=8）

3 讨论

近年来，黑色素瘤（melanoma）发病率快速增长，在所有肿瘤发病率增速中为最高［6］。黑色素瘤占皮肤肿瘤死亡病例的80%。肺部和脑转移是黑色素瘤患者死亡的主要原因，至今仍无有效的治疗药物。本研究的体外细胞模型显示Emo 对黑色素瘤B16F10细胞的侵袭重组基底膜、粘附细胞外基质（ECM）的特定分子、在ECM 上的迁移均有抑制作用。小鼠模型显示Emo 能抑制血循环中B16F10 细胞在肺部的锚定及形成转移灶，提示了Emo 具有抗B16F10 黑色素瘤转移的潜能。但对于人源性黑色素瘤细胞是否具有类似的作用，还需进一步研究。

粘附是恶性肿瘤形成克隆性转移灶的关键步骤。肿瘤细胞通过其表面成分如粘附分子（adhesion molecules，AMs）与ECM 中特定的配体结合，引起相关信号转导通路的激活，于是使某些基因的表达发生变化，肿瘤细胞的细胞骨架（微管、微丝等）发生组装和去组装，相应地肿瘤细胞在ECM 成分中不断地进行粘附和解粘附，从而形成了迁移（运动）。当肿瘤细胞发生迁移时，还需要降解ECM 成分（侵袭）以开辟前进的道路。因此，肿瘤细胞与基质的相互作用与肿瘤细胞的运动、侵袭相关［7］。在本实验中，显示Emo 对B16F10 细胞侵袭和迁移的抑制，可能与其抑制B16F10 细胞与特定ECM 成分FN、VN 的粘附有关。

本实验结果显示Emo 在小鼠模型中抑制B16F10 细胞对肺组织的粘附，这表明Emo 能抑制B16F10 细胞实验性肺转移的起始阶段。Emo 处理的B16F10 细胞形成肉眼可见的肺转移结节数量的减少，则说明Emo 能抑制B16F10 细胞实验性转移的较晚阶段。在这一模型中，血循环的B16F10 细胞需要粘附血管内皮细胞，侵袭内皮下基底膜才能在形成肺转移结节［8］。这一体内试验的结果与体外Emo对B16F10 细胞粘附、侵袭的抑制作用相一致。

本研究中使用体外细胞模型和动物模型证实了Emo 对B16F10 细胞粘附ECM 分子和肺组织的抑制作用。肿瘤细胞对ECM 成分粘附能力的改变，可能与其表面AMs 改变有关，后者如整合素（integrin）、钙黏素（cadherin）等。AMs 与ECM 结合后，可以将胞外的信号传导到胞内，引起包括粘着斑激酶（FAK）在内的一系列蛋白酪氨酸激酶激活。结合Emo 和AE 对其他细胞系作用的报道［9］，笔者拟将整合素αVβ3 与FAK 作为主要靶点，进一步分析Emo 抗B16F10 细胞转移的分子机制。

图4 大黄素对小鼠肺部转移结节数量的影响（x±s，n=8）