向圣锦，窦仁慧，姜小涵，李柏村，李佳

原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一种主要与基因缺陷相关的感光细胞及视网膜色素上皮变性，从而引起夜盲、进行性视野缩小、视力下降、眼底特征性改变的遗传性眼病。RP 在全世界范围内发病率约为1/3000～1/5000，是目前尚无有效的预防和治愈的一种致盲性眼病[1-2]。中医药治疗RP 有着悠久的历史，一些药物临床与实验研究均被证实对本病有一定疗效[3-4]。现在中医学逐渐总结和认识到肝肾阴虚、脾肾阳虚、清阳不升和血瘀脉涩是RP 的重要病机[5]。临证中，课题组应用温肾活血方（熟地黄、枸杞子、菟丝子、熟附子、肉桂、红参、当归等）为主加减治疗肾阳不足型RP，收效尚可。同时对历代治疗RP 的方剂配伍和临床用药规律总结发现，自近代医家以来，应用滋阴补肾兼活血化瘀或温补肾阳兼活血祛瘀法治疗RP 的报道亦越来越多，在提高视力、改善视野方面具有可靠疗效[6]。为进一步明确温肾活血方治疗本病的疗效机理，本研究以皇家外科学院(royal college surgeons,RCS)大鼠为研究对象，观察中药温肾活血方对RCS 大鼠视网膜感光细胞凋亡的影响，以探讨丰富温肾活血方治疗RP的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

RCS(rdy-/-，p-/-)大鼠，SPF 级（购自苏州昭衍新药研究中心有限公司，质量合格证号：201910067）；正常SD 大鼠，SPF 级（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号：201614068）。RCS 大鼠按4 雌2 雄进行交配得到纯合子胎鼠RCS 24 只（雌雄各半）；SD 大鼠8 只，雌雄各半，鼠龄2 周龄。所有大鼠均饲养在湖北中医药大学实验楼动物实验中心，SPF 级动物房饲养，标准颗粒饲料和无菌蒸馏水喂养，自由饮食，室内通风良好，室温22～25℃；予以12 h/12 h 的昼夜节律，光照时间6:00～18:00，每3～4 d 更换一次垫料。本研究经温州医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

温肾活血方（熟地黄、枸杞子、菟丝子、熟附子、肉桂、红参、当归等）。上述药物按原方购买三九制药有限公司浓缩中药配方颗粒，按体表换算系数换算后配置成相应浓度后，真空包装，4℃冰箱保存备用。TUNEL 凋亡荧光染色试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）；Caspase-3 抗体（艾博抗(上海)贸易有限公司）、Bcl-2、Bax（美国Thermo Fisher 公司），Trizol RNA 提取试剂盒（美国Life Technologies Corporation），M-MLV Reverse Transcriptase cDNA 第一链合成试剂盒（美国Invitro-gen 公司）。Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher 公司）。CRM-440 切片机，日本SAKURA 公司；光学显微镜，日本Olympus 公司，Axio Observe Z1 全自动倒置荧光光学显微镜。无水乙醇、异丙醇、氯仿等（北京化学试剂公司）；水合氯醛（国药集团工业股份有限公司）。

1.3 分组及给药

16 只RCS 大鼠按随机数字表法分为温肾活血方组（以下简称治疗组）和模型组，每组8 只，雌雄各半；同时设8 只SD 大鼠为正常对照组（以下简称对照组）。自2 周龄开始喂药。

（1）治疗组：予温肾活血方中药浓缩颗粒剂灌胃，灌胃浓度按中药浓缩颗粒10.29 g/kg 体重计算，初始灌胃量为0.5 ml/次，每日2 次，1 周后（出生3 周）改为1.0 ml，每日1 次。

（2）模型组和对照组：给予0.9%生理盐水灌胃，方法及频次同中药组。

3 组均于开始治疗后28 d 随机选取6 只大鼠处死，进行相应操作和各个实验指标测定。

1.4 视网膜组织病理学

水合氯醛麻醉过量处死各组大鼠，快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48 h，然后组织脱水、石蜡包埋，每组随机选择3 只眼球沿冠状面行4μm连续切片，苏木精-伊红染色（HE 染色）后于100 倍光学显微镜下观察视盘两侧各150 μm 视网膜各层形态和结构变化并拍照。

1.5 TUNEL 法检测感光细胞凋亡

取材时间和方法同上，制作视网膜石蜡包埋切片。按照TUNEL 试剂盒说明进行相关检测。切片DAPI 复染后荧光显微镜下观察，自视盘向锯齿缘方向连续取3 个视野，500 μm/视野，记录每个视野中染色阳性细胞数及感光细胞总数，抽样6 张不同切片，计算平均感光细胞凋亡率。细胞计数采用3YPixel-PRO 分析软件，感光细胞凋亡率(%)=阳性细胞数/感光细胞总数×100%。

1.6 免疫组化测定大鼠视网膜凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 表达

常规脱蜡、复水组织切片；根据所应用的一抗的特殊要求,对组织切片进行预处理；3%H2O2去离子水孵育10 min，用来阻断内源性过氧化物酶；PBS 冲洗2 min×3 次；滴加Caspase-3、Bax、Bcl-2 单克隆抗体，室温或37℃孵育1～2h 或4℃过夜，PBS 冲洗2 min×3 次；滴加试剂Polymer Helper，室温或37℃孵育20 min，PBS 冲洗2 min×3 次；滴加试剂聚氧化酶兔抗大鼠IgG,室温或37℃孵育20 min，PBS 冲洗2 min×3 次；应用DAB 溶液显色；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片；光学显微镜下观察、拍照。用Image Plus Pro 6.0 图像分析系统对相关凋亡蛋白阳性表达进行定量分析。每只大鼠取3 张不连续切片，每张切片随机选取6 处视野，计算阳性表达的平均密度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。所有结果用均数±标准差（）来表示。3 组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法，组内两两比较应用LSD-t 检验。结果以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织病理学变化

治疗后28 d，对照组SD 大鼠视网膜各层结构完整，外核层感光细胞排列紧密整齐，其外侧依次可见感光细胞的内节与外节。模型组RCS 大鼠视网膜外核层均较正常组明显变薄，细胞排列疏松，欠整齐；外层感光细胞数明显减少，其余结构基本正常。治疗组大鼠视网膜外核层亦较正常组变薄，感光细胞数量明显减少；但与模型组比较视网膜更厚，感光细胞层数较后者为多，细胞排列也较为整齐（图1）。

2.2 各组大鼠TUNEL 法检测视网膜感光细胞凋亡情况

图1 治疗前后各组大鼠视网膜病理学改变（HE 染色×400）。1A 对照组治疗前；1B 模型组治疗前；1C 治疗组治疗前；1D 对照组治疗后；1E模型组治疗后；1F 治疗组治疗后

治疗后28 d，对照组大鼠在视网膜外核层偶见阳性细胞，但模型组和治疗组大鼠视网膜外核层阳性染色细胞较正常组均明显增多，出现明显的细胞凋亡现象，但治疗组外核层阳性染色细胞较模型组少（图2）。对照组、模型组、治疗组感光细胞凋亡率分别为（12.15±3.83）%、（50.78±6.36）%、（33.53±6.26）%。3组之间经单因素方差分析，外核层细胞凋亡计数组间差异有显著统计学意义（F=71.58，P=0.000）。与模型组比较，治疗组凋亡细胞计数显著减少（t=4.74，P=0.001）

2.3 各组RCS大鼠视 网膜Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达

在治疗后28d，对照组SD大鼠视网膜各层结构形态规则，排列整齐，在视网膜外层可见少量Caspase-3、Bax 蛋白分散表达，Bcl-2蛋白表达水平较高。模型组和治疗组RCS大鼠视网膜各层结构紊乱萎缩变薄，病灶集中在外层视网膜，Caspase-3、Bax 蛋白表达在视网膜内外层均可见，但Caspase-3表达水平较对照组高，Bax 表达则同样较低；而Bcl-2蛋白表达水平则在视网膜各层均较对照组低（图3）。3组间比较，Caspase-3阳性表达水平（F=59.37，P=0.000）；Bcl-2阳性表达水平（F=31.35，P=0.000），均有显著统计学意义。Bax 阳性表达水平（F=1.69，P=0.190），差异无统计学意义。与模型组比较，治疗组Caspase-3表达显著减少（t=2.36，P=0.040），Bcl-2 表达显著增多（t=3.15，P=0.010），均有统计学意义。

图3 治疗后28d 各组视网膜Caspase-3、Bax 及Bcl-2 表达比较(×400)。3A-3C分别代表对照组、模型组、治疗组Caspase-3蛋白表达情况；3D-3F 分别代表对照组、模型组、治疗组Bax 蛋白表达情况；3G-3I分别代表对照组、模型组、治疗组Bcl-2 蛋白表达情况。Caspase-3、Bax、Bcl-2均呈绿色染色，阳性表达（白箭头）

3 讨论

RP 属于中医学“高风内障”“高风雀目”“阴风障”范畴。历代医家多认识到元阳（肾阳）不足在本病发病中具有重要作用。《目经大成》[7]认为该病的病机为元阳不足，阳不胜阴所致，曰：“至晚不见，晓则复明，盖元阳不足致病”“人而阳不胜阴，则气必下陷，阳气下陷，则阴气升腾，纵有火光月色，终不能睹”。《审视瑶函》[8]认为该病“盖元阳不足致病，或曰既阳不足”。因此，先天禀赋不足，元阳不足，命门火衰；阳虚日久，必损及阴，阴阳俱衰，阴阳不济，阳气不能为用。同时，阳虚无以鼓动血行，目中脉络瘀阻，气滞血瘀。李传课教授团队研究证实RP 证候具有虚中夹瘀的特点[9]。《眼科金镜》[10]认为该病是由于“阳光不足，肾阴虚损，乃阳微阴盛”所致。因此，先天禀赋不足，命门火衰，阳虚日久，阳损及阴，阴阳不济。同时，阳虚无以鼓动血行，目中脉络瘀阻，气血瘀滞是本病的重要病机[5,11]，治疗当温肾助阳、补肾填精，兼以益气活血。温肾活血方选用杜仲、菟丝子并配以大热之熟附子、肉桂温补肾阳，枸杞子、熟地黄滋补肾阴、益精明目，阴阳双补，并可阴中求阳，共补肾中真精元阳，具体较好的补肾明目功效。由于眼居高位，配以红参大补元气，补后天以资先天，并助肾中阳气蒸腾，直达病所；当归、川芎活血化瘀通络。诸药合之，共奏温补肾阳、活血明目之功，切中元阳不足、脉络瘀阻之病机。

RCS 大鼠是一种较成熟的视网膜退化性病变动物，因视网膜色素上皮细胞吞噬光感受器细胞外节盘膜能力缺陷，导致大量的盘膜碎片堆积，最终导致光感受器细胞进行性变性和凋亡，是一种常染色体隐性遗传病，具有人类RP 的主要特征，是广泛用于RP 病因及治疗方法研究的经典模型鼠[12]。既往研究发现，在出生14 d 时视网膜结构正常，之后睁眼并接受光线刺激后开始视网膜变性，在出生后28 d 可见视网膜明显变薄，感光细胞层数减少，外节不规则甚至消失，到42 d 时视网膜变性进一步加重，56 d 时则视网膜外层光感细胞完全消失[13]。因此，选择出生后42 d进行相关检测，即在视网膜感光细胞损伤较为严重阶段，评估温肾活血方对视网膜感光细胞的保护作用。

目前RP 的确切发病机制尚不完全清楚，但是大量研究已证实细胞凋亡是该病发生发展的重要分子机制，因此，通过有效的方法延缓或者抑制感光细胞的凋亡是治疗RP 的关键所在，对保护患者的视功能具有重要意义。本研究HE 染色结果显示，温肾活血方治疗后，RCS 大鼠视网膜各层结构排列相对规整，视网膜外层感光细胞层数以及细胞核密度较模型组有不同程度改善，说明温肾活血方能使RCS大鼠视网膜保留更多的感光细胞。同时，TUNEL 感光细胞凋亡染色进一步证实，凋亡阳性细胞表达程度与外核层变薄的程度具有一致性，温肾活血方能显著较少感光细胞凋亡，且高剂量组较低剂量组可以更显著降低感光细胞凋亡率，提示温肾活血方可以减少RCS 大鼠视网膜感光细胞凋亡，对视网膜损伤具有一定保护作用。既往也研究发现，温阳益气活血方可以有效抑制RDS 小鼠感光细胞的凋亡，保护视网膜外层损伤[4]。结合本研究结果，进一步说明温补肾阳、活血通络为主的治法可以较好地抑制元阳亏虚、脉络瘀阻所致RP 患者的视网膜感光细胞凋亡，进而达到保护和延缓视功能下降的目的。

Caspase-3 是外源性凋亡通路和内源性凋亡通路激活的Caspase 级联的启动因子，能够直接促发细胞凋亡，是最重要的凋亡执行者，一旦Caspase-3被激活并进一步激活下游信号通路，感光细胞凋亡就会启动[14]。Bcl-2 因子是重要的凋亡抑制因子，现已证实Bcl-2 可以阻断感光细胞的凋亡从而促进其存活[15]。为了进一步明确温肾活血方抑制或延缓感光细胞凋亡的机制，通过免疫组化测定了温肾活血方对RCS 大鼠视网膜凋亡相关蛋白表达的影响，结果发现的温肾活血方可以不同程度影响RCS 大鼠视网膜中凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 的表达，主要表现为抑制Caspase-3 的表达，并促进Bcl-2 的表达。由于细胞凋亡过程主要发生在视网膜外层，故凋亡蛋白的表达主要是由感光细胞诱导的。因此，温肾活血方可能主要通过抑制视网膜Caspase-3 的表达，并促进Bcl-2 的表达从而减少视网膜感光细胞凋亡，达到恢复和保护视功能的目的，但温肾活血方诱导感光细胞凋亡的下游分子机制仍值得进一步研究。

综上所述，本研究证实了温肾活血方可以抑制RCS 大鼠感光细胞变性和凋亡的进程，对视网膜变性具有一定的保护作用，其作用可能与抑制Caspase-3 并促进Bcl-2 的表达有关，但具体的分子机制还有待进一步研究。