李在望, 武晶晶， 王 倩， 涂景梅， 韩 晶

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在各国均有较高的发病率，常常导致严重的不可逆的功能缺损，例如肢体瘫痪、二便困难、性功能障碍等[1]。脊髓损伤后轴突不能有效再生是导致脊髓损伤患者遗留有严重残疾的重要原因，因此如何促进损伤轴突的有效再生便成了治疗脊髓损伤的关键[2]。SCI后，星形胶质细胞和小胶质细胞出现表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)的大量活化，这导致静息的星形胶质细胞活化分泌大量的轴突再生抑制因子如硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)等，形成致密的胶质瘢痕而抑制轴突的有效再生[3,4]；而小胶质细胞活化后可释放大量炎症因子导致神经毒性炎症损伤[5]。由此可见，SCI后EGFR活化导致的胶质细胞过度活化对轴突再生微环境起着不利的作用[3～5]。

但是另一方面，在SCI后的早期，活化胶质细胞形成的胶质瘢痕可以抑制病灶处的不良病理因素向正常组织扩散，对促进损伤轴突再生可能是有益的[6]。而活化的星形胶质细胞也可通过分泌胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)促进神经修复[7]。同时，活化的小胶质细胞可吞噬细胞碎屑和溃变的髓鞘，这对促进神经元修复同样可能是有益的[8]。由此可见，早期的星形胶质细胞和小胶质细胞活化增生对轴突的修复可能有一定的积极作用[6,8]。因此，在SCI后何时干预胶质细胞活化以最大程度的发挥其保护作用并尽可能抑制其损伤作用便是干预SCI的一个关键问题。

目前已有研究证实，EGFR抑制剂可以通过抑制EGFR活化而对脊髓损伤后小胶质细胞的活化和星形胶质细胞反应性胶质增生产生抑制作用而促进了神经功能的恢复[4,9]。但SCI后，何时启动EGFR抑制剂干预一直存在较大争议。奥希替尼是第三代EGFR抑制剂，能透过血脑屏障而作用于中枢神经细胞[10]，而且给药方便，故本研究以奥希替尼为干预药物。本实验拟通过在不同时间点应用奥希替尼对脊髓损伤进行干预，确定EGFR抑制剂奥希替尼干预SCI的最佳时间窗。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物:健康成年雌性SD大鼠(200 g～250 g)60只，购自常州卡文斯实验动物有限公司(实验动物合格证号201822084);(2)主要试剂与材料：奥希替尼(购于Med Chem Express公司)，兔抗growth-associated protein 43(GAP-43)(购于Invitrogen公司)，鼠抗glyceraldehyde phosphate dehydrogenase(GAPDH)(购于英国Abcam公司)。

1.2 奥希替尼溶液的配制 奥希替尼(osimertinib)粉末溶于生理盐水中，调配浓度为0.4 mg/ml。

1.3 大鼠脊髓损伤模型的制备及分组 200 g～250 g SD雌性大鼠60只，按随机数字表法将大鼠随机分为6组(n=10)：损伤对照组(injury组)、5个不同干预时间点的奥希替尼治疗组(0 d组、1 d组、3 d组、5 d组7 d组)。应用标准打击器制作大鼠脊髓损伤模型。选择T10应用龙胆紫做标记，碘伏消毒铺无菌巾后行背部正中切口，逐层分离肌肉，切断T9-T11棘突上的韧带及部分肌肉，充分暴露T9-T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜，应用打击器的钳夹系统固定T9、T11棘突，调整好打击棒的高度(打击棒重量为10 g，其打击头部直径为2 mm，其打击高度为1.25 cm，下落打击致伤能量为25 gcf)，使打击棒与T10段脊髓垂直，按下打击开关，打击棒垂直自由落下，打在硬脊膜表面，致伤后迅速移去打击棒，可见打击处硬脊膜迅速形成血肿，双下肢痉挛抖动，尾巴痉挛性摆动，视为造模成功。各组行肌肉和皮肤缝合。消毒、复温后将大鼠放回笼中。奥希替尼组按照组别分别在相应时间点给予奥希替尼溶液灌胃(2 ml/d)，对照组给予生理盐水灌胃(2 ml/d)，给药时长为SCI后2 w。

1.4 后肢运动功能评估 在脊髓损伤后第1天、第1周、第2周、第3周、第4周固定时间点观察各组大鼠行为学的改变。应用BBB评分量表评定大鼠脊髓损伤后神经功能缺损的情况，最小值为0分，表示未观察到后肢运动，最大值为21分为观察到后肢运动功能完全正常[11]。两人双盲独立观察记录评分结果，以防止主观因素的干扰。

1.5 残余尿量统计 大鼠脊髓损伤后，每天人工按摩腹部促进膀胱排尿两次，并应用带有刻度的小烧杯记录残余尿量以评估排尿功能。

1.6 脊髓GAP-43蛋白测定 各组大鼠(每组5只)于伤后14 d时深度麻醉后处死，快速剥取损伤节段脊髓组织，加人裂解液冰上孵育并彻底匀浆，离心后留取上清，BCA(bicinchonininc acid)法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；全湿式电转法转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%封闭液(1 g奶粉+20 ml含0.05%Tween-20的Tris-HCl缓冲盐溶，即TBST溶液)封闭2 h，分别加入一抗(兔抗GAP43，1∶500稀释)；内参为GAPDH，4 ℃孵育过夜。用TBST溶液洗涤10 min×3次；加入二抗(HRP标记羊抗兔IgG，1∶1000稀 释)，4 ℃过夜；TBST洗膜10 min×3次，加ECL发光显示液在暗室中摄像，凝胶成像分析系统进行分析。

1.7 统计学分析 实验数据采用SPSS 22.0、Graphpad 6.01等软件进行分析、制图。BBB评分及残余尿量以重复测量方差分析进行统计学分析，GAP-43应用单因素方差分析，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同时间点奥希替尼干预后运动功能评分分析 通过在不同时间点应用奥希替尼(EGFR抑制剂)干预脊髓损伤，并连续动态(每周)观察记录大鼠后肢运动功能评分(BBB评分)，以分析干预脊髓损伤最佳开始时间。研究结果显示：0 d组、1 d组及3 d组后肢运动功能评分接近，3组间评分无差异(P>0.05);而0 d组、1 d组及3 d组3组的评分均明显优于5 d组、7 d组及对照损伤组(P<0.05)。5 d组及7 d组这两组后肢功能评分与损伤组无明显差异(P>0.05);而5 d组、7 d组和损伤组间大鼠后肢功能恢复无明显差异(P>0.05)(见图1、见表1)。由此可见，在SCI后0～3 d应用EGFR抑制剂奥希替尼干预可获得最佳运动功能治疗效果。

2.2 不同时间点奥希替尼干预后残余尿量分析 本研究应用残余尿量评估各组大鼠的排尿功能。其中，0 d组、1 d组及3 d组的残余尿量分别较5 d组、7 d组及损伤组明显减少，重复测量方差分析提示差异有统计学意义(P<0.05);而0 d组、1 d组及3 d组3组间残余尿量很接近(P>0.05)。5 d组及7 d组这两组残余尿量均与损伤组无明显差异(P>0.05)；而5 d及7 d两组间残余尿量无明显差异(P>0.05)(见图2、见表2)。研究结果提示：在SCI后急性期(0～3 d)，应用EGFR抑制剂奥希替尼进行干预是促进排尿功能恢复的最佳时机。

2.3 不同时间点奥希替尼干预后GAP-43蛋白表达量分析 由于GAP-43表达增加与轴突生长和再生密切相关，因此，GAP-43成为神经再生的常用指标[12]。在本研究中，0 d组、1 d组及3 d组GAP-43的表达不仅高于5 d组及7 d组(P<0.05),而且明显高于损伤组(P<0.01);而0 d组、1 d组及3 d组3组间GAP-43表达无差异(P<0.05)(见图3)。这一结果表明：在SCI急性期(0～3 d)应用奥希替尼干预后轴突再生相关蛋白GAP-43表达水平最高。

表1 各组大鼠各时间点的BBB评分比较

表2 各组大鼠各时间点的残余尿量比较

图1 在不同时间点应用EGFR抑制剂( 奥希替尼)干预脊髓损伤，观察分组大鼠后运动功能恢复的差异。应用重复测量方差分析结果显示：0 d组、1 d组及3 d组这3组后肢功能评分均明显高于其他各组(P<0.05)

图2 在不同时间点应用EGFR抑制剂( 奥希替尼)干预脊髓损伤，比较各组大鼠残余尿量的差异。应用重复测量方差分析结果显示：0 d组、1 d组及3 d组这3组残余尿量均明显少于其他各组(P<0.05)

图3 在不同时间点应用EGFR抑制剂( 奥希替尼)干预脊髓损伤，比较各组大鼠SCI后14 d轴突再生相关蛋白GAP表达的差异。A图为各组GAP-43的Western blot的典型条带及GAPDH的条带；B图为各组GAP-43相对表达量分析条图*P<0.05，#P<0.01

3 讨 论

脊髓损伤后的神经功能缺损由原发性损伤和继发性损伤两种机制所致，而继发性损伤与SCI后过度胶质增生引发的反应性神经毒性炎症损伤密切相关[13]。机械暴力作用导致微血管内皮损伤，引发血脊髓屏障(BSCB)破坏，外周炎症细胞和炎症因子侵入脊髓神经组织。外伤和炎症因子的双重作用引发小胶质细胞和星形胶质细胞活化增生[14]。在损伤后的炎症微环境中，这两种胶质细胞相互应答，引发炎症反应升级[15]。这不仅导致神经元脱失和髓鞘破坏，还导致非损伤区的BSCB破坏，从而引起新一轮外周炎症细胞和炎症因子侵入脊髓组织，形成脊髓组织炎症损伤的恶性循环(即正反馈损伤)[1,8,16]。因此，阻断这种炎症损伤的恶性循环是干预SCI的关键策略。而SCI后星形胶质细胞和小胶质细胞出现过度活化增生是炎症损伤的一个核心环节。SCI后导致胶质细胞活化增生的机制尚未完全明确，但目前实验已证实，SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞均出现表皮生长因子受体(EGFR)的活化[3,4,9]。EGFR是位于细胞质膜上的受体型酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase，TPK)，在细胞存活、生长、分化、增生等信号转导通路中，起着关键性调节作用[17]。EGFR信号通路是调节中枢神经系统病变后胶质细胞活化增生的特异性转导信号通路[18]。

奥希替尼是第三代EGFR抑制剂，可透过血脑屏障，能有效抑制EGFR的活化[10]。在本实验中，我们选择奥希替尼作为干预SCI后过度胶质增生的药物。研究结果显示在SCI的急性期(0～3 d)给予奥希替尼进行干预，大鼠的运动功能及排尿功能恢复最佳，而且轴突再生相关蛋白GAP-43的表达也是最高的。研究结果表明应用EGFR抑制剂奥希替尼干预SCI应选择在SCI的损伤早期进行。

尽管有研究者认为在SCI早期星形胶质细胞和小胶质细胞的活化可能对损伤修复起一定的保护作用[15]，但SCI后胶质细胞的过度活化可引起的炎症级联反应产生反应性毒性神经炎症损伤，同时还可引发病灶周围正常脊髓组织的血脊髓屏障的破坏，导致炎症进一步扩展，形成恶性循环[8,16]。因此，及时阻断这种恶性炎症损伤的级联反应对减轻脊髓继发性损伤有着及其重要的意义。本研究结果提示SCI后尽早(前3 d)应用EGFR抑制剂进行干预才能获得最佳治疗效果，这与其它EGGR抑制剂干预中枢神经损伤的时机选择是一致的[3,4,9,19]。

总之，本实验通过在不同时间点应用EGFR抑制剂奥希替尼对脊髓损伤进行干预，观察SCI后大鼠运动功能及排尿功能恢复情况，并分析各时间点给药后轴突再生相关蛋白GAP-43的表达情况，研究结果显示：EGFR抑制剂奥希替尼干预脊髓损伤的最佳时间窗在SCI的急性期(0～3 d)。