赵 勇，曾玮荣，曾俊峰

武汉市第三医院检验科，湖北武汉 430060

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]。肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMCs)的基因表达谱与健康志愿者相比有明显差异[2]。非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)在DNA复制过程中起DNA修复调节作用[3]。YUAN等[4]发现PBMCs中的NS5ATP9 mRNA水平和蛋白水平均显著上调。白细胞介素-12p40(IL-12p40)是构成白细胞介素-12(IL-12)异源二聚体的两条链之一[5]。白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK-1)在启动针对外来病原体的先天免疫应答中起关键作用[6]。SIEDLAR等[7]发现，在胃癌患者的PBMCs中IL-12p40和IRAK-1的mRNA水平受到明显的抑制。然而，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平联合检测对早期胃癌的诊断价值尚未见报道，故本研究对此进行了探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2017年11月至2019年11月本院收治的早期胃癌患者112例作为早期胃癌组；其中男55例、女57例，年龄37～79岁、平均(48.05±23.05)岁，肿瘤最大径1.3～6.4 cm、平均(3.76±2.04)cm，TNM分期：Ⅰ期81例、Ⅱ期31例。将同期本院收治的胃部良性疾病患者112例作为良性组；其中男63例、女49例，年龄35～81岁、平均(46.39±21.04)岁，胃溃疡54例、浅表性胃炎38例、萎缩性胃炎20例。112例早期胃癌患者和112例胃部良性疾病患者均经本院病理科证实。排除标准：(1)严重心、肝、肾功能损伤者；(2)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(3)患有精神疾病者；(4)患有其他癌症者。另外，将同期于本院进行体检的体检健康者112例作为对照组；其中男56例、女56例，年龄32～74岁、平均(45.70±19.97)岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入研究者均签署知情同意书。

1.2方法 抽取上述三组人群(早期胃癌和良性组患者于治疗前)肘前静脉血15 mL。使用北京绿源伯德生物科技有限公司的PBMC细胞提取试剂盒提取PBMCs,使用北京源畅致和生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(RNAsimple总RNA提取试剂盒)进行总RNA抽取。使用微克特锐生物科技(武汉)有限公司的反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。使用广州铖铵生物科技有限公司的SYBR green试剂和表1中的引物进行NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA相对水平检测。所有反应一式三份，去掉极大值和极小值，以2-ΔΔCT进行mRNA相对水平的计算。

表1 NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的引物序列(5′-3′)

1.3统计学处理 SPSS22.0软件进行统计分析，多组间比较采用one-way ANOVA检验，方差齐者采用t检验比较，方差不齐者采用Tamhane′T2法比较。应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)下的面积(AUC)分析PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1检测早期胃癌的临床诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1三组间PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相对水平的比较 三组间NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相对水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 三组间PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相对水平的比较

2.2三项PBMCs mRNA指标用于早期胃癌与胃部良性疾病鉴别诊断的效能 NS5ATP9的AUC为0.89(95%CI：0.85～0.94)，以0.939 7为诊断界值，灵敏度和特异度均为91%；IL-12p40的AUC为0.86(95%CI：0.81～0.91)，以0.119 8为诊断界值，灵敏度为87%，特异度为88%；IRAK-1的AUC为0.92(95%CI：0.88～0.97)，以2.095 0为诊断界值，灵敏度为93%，特异度为92%。见图1、表3。

表3 三项PBMCs mRNA指标用于早期胃癌与胃部良性疾病鉴别诊断的效能

图1 三项PBMCs mRNA指标用于早期胃癌与胃部良性疾病鉴别诊断的ROC曲线

2.3三项PBMCs mRNA指标用于区分早期胃癌患者与体检健康者的诊断效能 NS5ATP9的AUC为0.95(95%CI：0.92～0.98)，以0.070 4为诊断界值，灵敏度、特异度分别为96%、94%；IL-12p40的AUC为0.91(95%CI：0.86～0.96)，以0.030 7为诊断界值，灵敏度、特异度分别为92%、91%；IRAK-1的AUC为0.96(95%CI：0.93～0.99)，以0.085 9为诊断界值，灵敏度和特异度均为95%。见图2、表4。

表4 三项PBMCs mRNA指标用于区分早期胃癌患者与体检健康者的诊断效能

图2 三项PBMCs mRNA指标用于区分早期胃癌患者与体检健康者的ROC曲线

2.4三项PBMCs mRNA指标对早期胃癌的联合诊断结果 患有早期胃癌的为真阳性，未患有早期胃癌的为真阴性。NS5ATP9以0.939 7为诊断界值，IL-12p40以0.119 8为诊断界值，IRAK-1以2.095 0为诊断界值，三项均为阳性则联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。三项PBMCs mRNA指标联合诊断早期胃癌的灵敏度为92.86%(104/112)，特异度为93.30%(209/224)，准确度为93.15%(313/336)，见表5。

表5 三项PBMCs mRNA指标联合对早期胃癌的诊断结果(n)

3 讨 论

自2008年以来，胃癌已被列为全球第四大最常见的恶性肿瘤，每年估计有980 000例新病例和738 000例与癌症相关的死亡病例[8]。胃癌的发病率因国家而异，东亚国家发病率最高。胃癌的预后很差，因为许多患者确诊时已经为疾病晚期，没有手术治愈的可能。因此，迫切需要开发新的生物标志物，特别是非侵入性的替代生物标志物，用于早期胃癌的诊断，从而改善预后。此外，筛选出可用于预测胃癌患者临床结局的新型分子标志物也有助于制订更好的治疗策略来有效控制该疾病。尽管已有几种肿瘤生物标志物，如癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)，用于胃癌的诊断或预后判断，但均未显示出理想的敏感性和/或特异性[9]。因此，迫切需要更特异、敏感的肿瘤生物标志物对早期胃癌进行诊断。本研究对早期胃癌组、良性组和对照组受试人员血液中PBMCs的NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA表达量进行了检测，并通过ROC曲线分析，发现PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA的联合检测对早期胃癌诊断的灵敏度为92.86%，特异度为93.30%，准确度为93.15%。

PBMCs是免疫系统的重要组成部分，包括单核细胞、T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。本研究中发现，早期胃癌患者、胃部良性疾病患者和体检健康者PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平有明显差异。与以前的血液中的标志物相比，PBMCs中的mRNA能够更加稳定地存在[10]。PBMCs表达人类基因组编码的大约80%的基因，这些基因对在宏观和微观环境中发生的机体变化做出响应[11]。近年来，人们越来越多地探索了它们在评估人体生物学状态方面的用途。例如，已经证明PBMCs中基因表达的改变可反映人体的恶性肿瘤[12]。癌细胞与PBMCs之间的相互作用非常复杂，涉及免疫系统对肿瘤的识别和肿瘤对免疫系统的逃避。因此，本研究创新性地使用PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA作为指标来评估其对早期胃癌的诊断价值。

NS5ATP9是一种相对分子质量为15×103的蛋白质，含有保守的增殖细胞核抗原(PCNA)结合基序[3]。NS5ATP9用于早期胃癌与胃部良性疾病鉴别诊断的灵敏度和特异度均为91%，用于区分早期胃癌患者与体检健康者的灵敏度和特异度分别为96%和94%。NS5ATP9蛋白在许多不同类型的人类恶性肿瘤组织中过表达，包括肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、肾上腺和胰腺肿瘤，表达水平与患者预后不良有关[13]。此外，体外研究表明NS5ATP9的过表达促进肿瘤细胞的生长，小干扰RNA引起的NS5ATP9的水平降低导致细胞活力的降低[14]，表明NS5ATP9在癌变和癌症的发展中起着重要的作用。

IRAK-1是参与核因子κB(NFκB)/活化蛋白-1(AP-1)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)依赖性促炎蛋白合成的信号转导关键激酶之一，特别是在脂多糖、脂肽、透明质酸、热休克蛋白或坏死细胞等刺激单核细胞/巨噬细胞后[15]。本研究中用于早期胃癌与胃部良性疾病的鉴别诊断，IL-12p40、IRAK-1的灵敏度分别为87%、93%，特异度分别为88%、92%。用于区分早期胃癌患者与体检健康者，IL-12p40、IRAK-1的灵敏度分别为92%、95%，特异度分别为91%、95%。由于IRAK-1是信号级联反应中必不可少的分子，因此其下调会阻碍信号转导及对肿瘤坏死因子(TNF)和IL-12p40生成的诱导作用[16]。用胰腺癌细胞刺激人单核细胞会导致IRAK-1蛋白表达的显著抑制，这与肿瘤细胞再刺激后TNF和IL-12p40的生成减少有关，但与IL-10的生成无关[17]。因此，IRAK-1蛋白表达下调导致胃癌细胞逃避免疫监控，促进了胃癌的发展。

与周丽华等[18]报道的血清亲环素B(CypB)76.36%的灵敏度，75.51%的特异度相比，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1联合对早期胃癌诊断的灵敏度为92.86%，特异度为93.30%，准确度为93.15%，具有较高的诊断价值。与刘云云等[19]报道的靛胭脂染色内镜诊断早期胃癌相比，本研究的联合诊断除了具有灵敏度和特异度的优势外，还具有操作简便的特点。

综上所述，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA是早期胃癌诊断的潜在标志物。但本研究仍然有不足之处，如各组纳入的样本量较少，还需继续增加样本量并进一步地进行研究。