陈幽攸,任小群，杨 探，李华云，代 颜△

西南医科大学附属医院：1.药学部；2．心脏大血管外科，四川泸州 646000

华法林是临床常用的香豆素类抗凝药物，主要通过拮抗维生素K起效，适用于预防静脉血栓栓塞性疾病、房颤血栓栓塞与人工瓣膜置换术、瓣膜病等，但其治疗窗狭窄，对个体的作用效果差异较大。抗凝治疗的剂量不够容易导致血栓形成，过度抗凝治疗则会增加出血风险，这就需要找到抗凝治疗剂量的平衡点。因此，选择适宜患者个体的精确剂量是抗凝治疗的关键[1-2]。

随着药物基因组学的发展，研究发现，华法林相关的药物基因多态性会对其用药方案产生影响。华法林在体内主要经细胞色素P450同工酶2C9(CYP2C9)代谢为无活性代谢产物，CYP2C9*2(c.430C>T,rs1799853)和CYP2C9*3(c.1075A>C,rs1057910)是CYP2C9发生了多态性位点突变的主要基因型，这两种突变均会导致其酶活性降低，故携带变异基因的患者应降低华法林剂量以防止发生严重的药物不良反应[3]。华法林的作用靶点为维生素K环氧化物还原酶复合体亚基1(VKORC1)，携带VKORC1基因启动子区-1639G>A(rs9923231)单核苷酸变异的患者对华法林敏感性增加，需降低剂量[4-5]。因此，影响药代动力学的CYP2C9与药效动力学的VKORC1基因多态性是华法林相关药物基因组学的研究重点，能解释30%～60%的华法林对个体作用的差异。美国食品药品监督管理局(FDA)也在华法林使用说明书中建议结合VKORC1和CYP2C9基因型考虑华法林的初始用药剂量，将这两个基因的多态性位点检测结果结合多个临床因素建立的遗传药理学剂量模型能在优化给药方案中起指导作用[1,6-7]。目前，主要的模型算法包括国际华法林遗传药理学协会(IWPC)建立的华法林剂量计算公式[8]、由华盛顿医学中心和美国国立卫生研究院等机构提供支持的Warfarin Dosing网站(http://www.warfarindosing.org)公布的计算公式及2015年由国家卫生和计划生育委员会印发的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中提出的基于中国人群的华法林用药剂量计算公式。本研究探讨了泸州及周边地区汉族人群中CYP2C9与VKORC1基因型的分布频率，并基于基因型检测结果与患者个体信息，分别利用上述3种算法预测心脏瓣膜置换术后患者服用华法林的剂量，比较三者的差异，旨在为华法林个体化用药的相关工作提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 从2018年6月至2019年7月在西南医科大学附属医院心脏大血管外科行心脏瓣膜置换术(包括二尖瓣置换、三尖瓣置换、主动脉瓣置换、BenTall术等)后需长期使用华法林进行抗凝治疗并进行了CYP2C9 430、1075和VKORC1-1639位点基因检测的泸州及周边地区汉族住院患者中，共获取有效病例120例并纳入研究，其中女72例、男48例，年龄19～75岁，平均(52.28±9.75)岁，对本研究均知情同意。为计算华法林个体化用药剂量，收集患者性别、年龄、身高、体质量、适应证、吸烟史、肝功能、合并用药情况等生理、病理信息。

1.2仪器与试剂 BIO-Ⅱ-A生物安全柜(Telstar Industrial公司)、K30干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)、Sorvall ST 8R高速冷冻离心机(Thermo Electron LED GmbH公司)、XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；BR-526-24全自动杂交仪、BE-2.0生物芯片识读仪、核酸提取试剂盒、CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒(PCR-芯片杂交法)、免疫显色试剂盒均购自上海百傲科技有限公司。

1.3方法

1.3.1CYP2C9和VKORC1的基因检测 取受检者外周静脉血2 mL至EDTA抗凝管中，采用DNA提取纯化试剂盒抽提DNA。在扩增液中加入待测DNA溶液与反应液A，在PCR仪中按程序扩增，定期进行阳性、阴性对照品试验以确保结果准确性。采用微阵列基因芯片法在全自动杂交仪上按照CYP2C9和VKORC1检测杂交程序运行。使用生物芯片识读仪检测基因芯片，ArrayDoctor软件扫描信号判读CYP2C9和VKORC1基因型。

1.3.2华法林个体化剂量计算及比较 基于患者的生理病理信息分别利用以下3种算法计算其华法林个体化剂量：(1)IWPC公式；(2)Warfarin Dosing网站；(3)《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中的基于中国人群的华法林用药计算公式(以下简称中国公式)。对5种基因型患者3种算法的计算剂量进行比较，同时将3种算法计算剂量的平均值进行比较，并且与FDA在华法林原研药COUMADIN®说明书中推荐的剂量范围[9]进行比较。Warfarin Dosing网站不支持20岁以下患者的剂量预测，为便于比较，本研究将19岁的患者以20岁计算。

2 结 果

2.1多态性位点的基因型频率分布 120例患者中共检出了5种基因型组合，未检出CYP2C9*2。CYP2C9 1075位点AA与AC型的患者分别占90.83%(109/120)和9.17%(11/120)，VKORC1-1639位点AA、AG、GG型的患者分别占88.33%(106/120)、10.83%(13/120)和0.83%(1/120)。所有基因型分布均通过了Hardy-Weinberg遗传平衡检验(P>0.05)，可进行后续分析，见表1。

表1 CYP2C9 430、1075位点和VKORC1-1639位点的基因型分布[n(%)]

2.23种算法得到的剂量比较 由3种算法计算剂量的平均值可看出，携带这5种基因型的患者中所需华法林剂量最高者为CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG基因型的患者，最低者为CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA基因型的患者。将3种算法计算剂量的平均值与FDA推荐的剂量进行比较，仅有CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG与CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG基因型患者的平均计算剂量在FDA推荐的范围内，但因该两种基因型患者仅有1例，样本量不足，而其他3种基因型患者的平均计算剂量均未在FDA推荐的剂量范围内，说明该范围不适用于中国人群。将CYP2C9与VKORC1基因型分类比较发现，VKORC1 AA、AG、GG基因型间计算剂量的差异大于CYP2C9*1/*3、*1/*1基因型间的差异，说明VKORC1-1639位点的变异比CYP2C9 1075位点的变异对华法林计算剂量的影响更大。见表2。

表2 5种基因型患者3种算法计算剂量的比较(mg/d)

2.3一致性分析 IWPC公式的计算剂量比中国公式平均高0.13 mg/d，见图1。IWPC公式与中国公式的计算剂量差值在95%置信区间(CI)以外的概率为5.83%(7/120)；两种计算方法差值的绝对值最大为0.98 mg/d；两者计算剂量差值超过95%CI以外的患者中有4例患者是CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA基因型，另3例患者为CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA基因型。

注：虚线表示两种算法预测剂量差值为0；中实线表示所有差值的平均值；上下实线表示差值的95%CI。

Warfarin Dosing网站计算的华法林剂量比中国公式的计算剂量平均低0.14 mg/d，见图2。两种算法计算剂量差值不在95%CI内的概率为4.17%(5/120)；两种计算方法差值的绝对值最大为0.92 mg/d，该患者基因型为CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG，因该基因型患者只有1例，该基因型患者用两种方法计算所得结果差异较大的原因还有待进一步研究。除该患者外，计算剂量差值超过95%CI以外的4例患者中有2例患者基因型为CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA，另2例患者基因型分别为CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA和CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AG。对IWPC公式、Warfarin Dosing网站与中国公式算法的差值超出95%CI的患者进行对比，有1例患者的计算剂量差值在两组一致性分析中均在95%CI以外，该患者年龄为19岁。

注：虚线表示两种算法预测剂量差值为0；中实线表示所有差值的平均值；上下实线表示差值的95%CI。

3 讨 论

作为心脏瓣膜置换术后用于终生抗凝治疗的一线口服抗凝药物，华法林的合理用药一直是临床关注的重点之一。对于行心脏瓣膜置换术后的患者而言，术后1个月是发生血栓栓塞及严重出血事件的高危时期[10-11]。目前，国内临床上使用华法林的传统方案为给予固定剂量(一般为2.5 mg/d)，然后通过监测国际标准化比值(INR)反复调整剂量。然而这种方案很难快速获得理想的抗凝治疗效果，在此期间患者形成血栓和出血的危险性很高。有学者报道，使用计算公式预测华法林个体化剂量能够明显改善患者短期预后，缩短达到治疗所要求INR的时间，患者能在抗凝治疗开始的1个月内明显获益[6,12]。

近年的药物基因组学研究发现与华法林药效学与药物动力学相关的基因超过30种[13]。在欧洲人群患者中，CYP2C9、VKORC1与CYP4F2的常见变异可分别解释18%、30%、11%的华法林稳定剂量的变化[6]。但目前国内进行个体化用药相关的基因检测的成本相对较高，出于成本-效益比的考虑，是否应对有影响的基因均进行检测还有待商榷，而且还应考虑到不同人种间基因变异的流行程度。例如，相比Warfarin Dosing网站计算中包含的多个基因多态性因素，中国公式中仅纳入了CYP2C9*3与VKORC1的基因多态性，就是因为中国人群中基本不会出现CYP2C9*2[14]。本研究中，也没有检出CYP2C9*2情况。在国家药品监督管理总局网站(www.nmpa.gov.cn)上查询到，获得第三类医疗器械注册证批件的华法林药物代谢基因(CYP2C9 & VKORC1)多态性检测体外诊断试剂盒共有7个，其中有5个试剂盒均包含了CYP2C9*2的检测，事实上对于中国患者而言意义不大，会增加不必要的经济成本，阻碍华法林个体化用药基因检测的应用。

除患者几个基本信息外，3种模型算法所需的计算因素稍有区别。相同的计算因素为基因型、年龄、身高、体质量、人种。不同的计算因素：IWPC公式为合并用药(酶诱导剂、胺碘酮)；Warfarin Dosing网站为有无吸烟史、肝功能、适应证、基础INR、目标INR、合并用药(胺碘酮、他汀类药物、唑类抗真菌药、磺胺甲噁唑等)；中国公式为有无吸烟史、性别、是否置换主动脉瓣膜、是否合并有房颤、合并用药(阿司匹林、胺碘酮)。3种算法中所需计算因素最多的是Warfarin Dosing网站，除多个合并用药的影响外，还考虑了除CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639外的其他基因变异，如CYP4F2、GGCX、CYP2C9*5、CYP2C9*6，也能利用患者基础INR与目标INR获得更准确的推荐；但因该模型主要基于外国人群建立，故中国公式的提出可能更适合中国人群华法林个体化剂量的计算，并将性别及部分病理状态都纳入了考量。

通过将中国公式与国际上普遍承认的IWPC公式与Warfarin Dosing网站的遗传药理学模型相比较，中国公式与后两者均有较高的相关性。目前国内华法林钠片的规格有1.0、2.5、3.0与5.0 mg，国外进口华法林钠片规格有1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mg，但国内临床上普遍使用的是2.5 mg规格，因此对大部分患者而言，3种公式间计算剂量的差异并不容易在实际服用剂量中体现，因此3种算法计算剂量的差异均在可接受的范围内，中国公式的计算剂量能够达到较高的准确度。若能够获得患者的详细信息，建议优先使用中国公式与Warfarin Dosing计算，因相对于IWPC公式而言这两种计算方法涵盖的临床因素更全面，能提供更精确的华法林推荐剂量。

中国公式仍存在一些不足，Warfarin Dosing网站与IWPC公式主要支持对20岁以上患者的剂量计算，而中国公式未明确提出年龄的要求。本研究中纳入的19岁患者通过IWPC公式与Warfarin Dosing网站计算得到的剂量与中国公式的差值均超过了95%CI。目前，国际上已有研究者提出了基于欧洲儿童CYP2C9*2/*3与VKORC1-1639G>A基因型的华法林剂量计算方法[15]，但还没有公认的基于大样本研究验证的可以较准确预测中国儿童华法林剂量的模型算法，这也是中国公式后期有待完善之处。

与传统的给药方案比较，基于基因型的剂量预测能够在一定程度上缩短用药初期反复调整华法林剂量的时间，但并不能完全保证可以改善患者预后。患者在整个抗凝治疗过程中，生理、病理状态处于一个动态变化的过程，其个体化华法林剂量的需求会随着疾病状态、合并用药、饮食等种种原因发生改变；如过分相信基因检测技术与剂量预测模型，而误认为只要使用该计算剂量即定能获得安全的治疗，可能会对患者造成严重后果。因此在整个华法林用药过程中应持续进行INR的监测与长期的药学监护，在用药过程中发现影响因素并反馈到预测模型中，不断完善模型算法。

综上所述，本地区汉族人群中存在CYP2C9 1075与VKORC1-1639位点的多态性，基因型以CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA型为主。建议患者服用华法林前先进行CYP2C9、VKORC1的基因多态性检测，利用计算因素更全面的中国公式与Warfarin Dosing网站预测初始剂量，并在后期持续监测INR。