宋延静 马兰 李俊林 单燕 王洁 赵玲玲 王向誉

摘要：芦苇是山东省盐渍化地区常见的湿地盐生植物，对氮素转化以及氮去除有重要作用，其中微生物介导的反硝化过程被认为是主要的除氮机理。本研究以山东省不同盐渍化地区的芦苇根际土为材料，采用荧光定量PCR技术及高通量测序技术，对nirS、nirK及nosZ3种基因型反硝化细菌的丰度以及nosZ基因型反硝化细菌的多样性、群落分布进行比较分析。结果表明，山东省盐渍化地区的芦苇根际中nosZ基因的拷贝数最高，昌邑和寿光地区的芦苇根际nirK基因拷贝数高于nirS，东营和滨州的芦苇根际nirS基因拷贝数高于nirK。固氮螺菌属（Azospirillum）是山东省盐渍化地区芦苇根际的优势反硝化细菌，尤其在昌邑（39.1%）和滨州地区（35.1%），Oligotropha是寿光芦苇根际丰度最高的反硝化菌（27.3%），假單胞菌属（Pseudomonas）是东营地区芦苇根际丰度最高的反硝化细菌（34.4%）。滨州地区的芦苇根际反硝化细菌多样性最高。昌邑和寿光两地的芦苇根际nosZ反硝化细菌群落结构相似，东营和滨州两地nosZ反硝化细菌群落组成差异较小。土壤的含盐量、Na+含量、含水量、总碳含量、铵盐以及pH值等环境因子均可影响芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌的群落结构。

关键词：芦苇;反硝化细菌;nirS、nirK、nosZ基因;荧光定量PCR;高通量测序

中图分类号：S564+.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0137-06

反硝化作用被认为是最主要且有效的氮素削减途径，其气体产物N2O是三大温室气体之一[1]。大量研究表明反硝化过程所需的酶类并不能够由某一类微生物单独产生，而是需要通过多种微生物共同作用[2]。随着微生物分子生态技术的发展，可以利用功能基因对环境中反硝化功能微生物的群落结构进行研究。编码亚硝酸还原酶的基因nirS与nirK是反硝化微生物种群研究中普遍使用的分子标记物，其参与的亚硝酸盐还原反应是一氧化氮产生的步骤[3];另外一个在反硝化微生物种群研究中应用相当广泛的基因是编码N2O还原酶（Nos）的nosZ基因[4]，该酶在N2O和N2的产生过程中起重要作用。nirS、nirK与nosZ之间的平衡关系可以作为土壤N2O排放能力的一个参考指标[5]。

山东省的盐渍化地区多为滨海湿地生态系统，芦苇根系发达，抗逆性强，是该地区常见的湿地盐生植物，在氮素转化和去除过程中起重要作用，因此芦苇的种植有利于提高湿地脱氮能力。植物根际作为一个特殊的微生物生态环境，对微生物的生长有重要作用。前期研究发现黄河三角洲地区芦苇根际氨氧化微生物的组成和分布存在差异[6]，本研究基于nirS、nirK、nosZ功能基因，结合荧光定量PCR技术与高通量测序技术对山东省不同盐渍化地区（滨州、东营、昌邑、寿光）芦苇根际反硝化微生物的丰度、多样性和群落结构进行比较，同时研究其与环境因子的相关性，以期为山东省盐渍化土壤生态环境的合理开发利用及保护提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2017年11月沿山东省海岸线进行盐渍化土壤背景下的芦苇资源调查及其根际土的收集，采样点位图见参考文献[7]的图1。土壤具体理化性质见参考文献[6]。

1.2 土壤DNA的提取和高通量测序

按照FastDNA SPINKitforSoil试剂盒说明书步骤提取DNA，用分光光度计（NanoDrop2000c）测定DNA的浓度及纯度。利用nosZ基因特异性引物进行PCR扩增（表1），然后利用IlluminaPE250测序平台进行测序（上海凌恩生物科技有限公司）。

1.3 荧光定量PCR

nirS、nirK、nosZ三个基因的拷贝数采用TBGreen荧光定量PCR法获得，具体引物信息见表1，反应在BioRadCFX96平台上进行。稀释相应的质粒至10-1～10-8，并绘制标准曲线。每个样品3次重复，设不加模板的反应管为阴性对照。

1.4 高通量数据分析

反硝化微生物的多样性分析基于nosZ基因进行，高通量数据分析基于Linux平台的QIIME1.9.0流程，参考数据库为FGR（version7.3）。具体流程如下：过滤read尾部质量值20以下的碱基和质控后50bp以下的read;筛除错配比率大于0.2的拼接序列;用Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体，并选取97%的序列相似度作为阈值（cutoff）划分OTU;采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。

1.5 数据处理

利用SPSS20统计软件中的单因素方差分析（ANOVA）检验不同采样点芦苇根际土中nirS、nirK、nosZ基因拷贝数的差异显著性;利用mothur计算不同地域芦苇根际反硝化微生物类群的α多样性指数;利用Primer软件进行聚类树分析;应用CANOCO软件中的典范对应分析（CCA）探索微生物群落结构与环境变量之间的关系[12]。

2 结果与分析

2.1 芦苇根际nirS、nirK、nosZ基因拷贝数的比较

荧光定量PCR结果（图1）显示，4个采样点的芦苇根际反硝化功能基因的拷贝数表现为nosZ基因拷贝数最高，其次是nirK和nirS基因。昌邑和寿光地区的芦苇根际nirK拷贝数高于nirS拷贝数，东营和滨州地区的芦苇根际nirS拷贝数高于nirK拷贝数。

对于nosZ基因，东营地区拷贝数最高，平均值为4.88×109 copies/g;其次是滨州地区（4.49×109copies/g）;寿光和昌邑的nosZ拷贝数相对较低，分别为8.37×108copies/g和2.91×108copies/g。对于nirS基因，东营地区的芦苇根际拷贝数最高，为7.17×108copies/g;其次是滨州地区，平均值为1.85×108copies/g;昌邑地区的芦苇根际nirS拷贝数最低，为6.94×106copies/g。对于nirK基因，滨州地区芦苇根际拷贝数最高，为1.36×108copies/g;其次依次为昌邑、东营和寿光，平均值分别为8.22×107、6.95×107、2.83×107copies/g。

2.2 芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌的α多样性

对nosZ基因进行高通量测序，结果（表2）表明，采样点芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌的OTU数量平均在999～1755之间。由Chao1指数可知，各采样点的芦苇根际反硝化微生物丰富度排序为昌邑>滨州>寿光>东营;由Shannon指数可知，各采样点的芦苇根际反硝化细菌多样性滨州>昌邑>寿光>东营;由Simpson指数可知，各采样点的芦苇根际反硝化细菌多样性滨州>东营>昌邑>寿光。

2.3 芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌群落组成分析

山东省盐渍化地区芦苇根际反硝化细菌主要为变形菌门（Proteobacteria）。从图2可以看出，从属水平来看，固氮螺菌属（Azospirillum）是芦苇根际优势反硝化菌属，尤其是昌邑（39.1%）和滨州地区（35.1%）;盐单胞菌属（Halomonas）是滨州芦苇根际除固氮螺菌属以外丰度最高的优势菌（22.2%），该菌在其它三地芦苇根际含量较低，丰度均不到1%;Oligotropha是寿光芦苇根际丰度最高的反硝化细菌（27.3%），中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）是昌邑地区除固氮螺菌属以外丰度最高的反硝化细菌（28.5%），假单胞菌属（Pseudomonas）是东营地区芦苇根际丰度最高的反硝化细菌（34.4%）。在4个不同采样点的芦苇根际还发现很大比例的未知微生物，尤其是东营和寿光地区。其他相对丰度较高的芦苇根际优势反硝化菌属还包括红细菌属（Rhodobacter）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、鲁杰氏菌属（Ruegeria）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等。

2.4 芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌在山东省不同盐渍化地区的空间分布差异及环境影响因子

聚类树分析结果（图3）表明，芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌被分为两大分支，第一大分支包含壽光（SG）和昌邑（CY），第二大分支包含东营（DY）和滨州（BZ）。结合样本在树状图中的位置以及树状图中树枝长度可知，东营和滨州地区的芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌群落组成相似度较高，寿光和昌邑地区的芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌群落组成差异较小。

典范对应分析（图4）发现山东盐渍化地区芦苇根际反硝化细菌的群落结构受含盐量、Na+含量、含水量、总碳含量、铵盐、pH值的影响较大。第一轴解释率为43.9%，第二轴解释率为28.7%。

3 讨论与结论

芦苇根系发达，繁殖速度快，是山东滨海盐渍化地区常见的盐生湿地植物。芦苇发达的根系为微生物的生长提供了依附介质和环境，植物根系的分泌物和脱落物是微生物生长的重要营养来源。芦苇-微生物系统对该地区的氮素循环尤其是反硝化过程有巨大影响。

3.1 山东省盐渍化地区芦苇根际不同基因型反硝化细菌的丰度特征

本研究发现山东滨海盐渍化地区的芦苇根际反硝化细菌中nosZ基因型占主导。

有研究表明，nirS型与nirK型反硝化细菌在不同的环境中均可共存，但不同的环境中nirK与nirS的丰度不同，通常认为nirS型反硝化细菌具有更高的基因丰度，在环境中占据主导地位，而nirK型反硝化细菌存在于更为广泛的微生物种群中[2，13];也有研究表明土壤样品中nirK基因的拷贝数高于nirS[14]。本试验结果表明，对于昌邑和寿光地区，芦苇根际nirK拷贝数高于nirS拷贝数，对于东营和滨州地区，nirS拷贝数高于nirK拷贝数。前人研究表明环境中nirS与nirK的丰度差异取决于样带及养分含量[15]，nirS型反硝化细菌更适于有机碳、NO-3 -N含量高的环境[16，17]，nirK型反硝化细菌在对不同环境梯度的响应中表现出了更为强大的生境选择。本研究结果显示东营和滨州地区土壤中的有机碳含量等显著高于昌邑和寿光地区，因此更适宜于nirS基因型反硝化细菌的生长。

3.2 山东省盐渍化地区芦苇根际nosZ基因型反硝化细菌的分布特征

在门水平上，山东省不同盐渍化地区芦苇根际反硝化细菌表现一致，主要为变形菌门，与大多数研究结果一致[18，19]。在属水平上，4个地区芦苇根际反硝化细菌具有差异，变形菌门γ纲的固氮螺菌属（Azospirillum）是4个地区中芦苇根际的优势反硝化菌属。固氮螺菌是一种主要的固氮细菌，与禾本科作物起到联合固氮的作用。盐单胞菌属（Halomonas）是滨州芦苇根际丰度较高的反硝化菌属（22.2%），但盐单胞菌属在其它3地的芦苇根际丰度较低，均不到1%。盐单胞菌是可培养的优势好氧反硝化菌，且嗜盐，适宜碱性土壤，盐单胞菌属在滨州地区的高丰度可能与该地区土壤盐分、pH 值较高有关。假单胞菌属（Pseudomonas）是东营地区芦苇根际的优势反硝化细菌（34.4%），假单胞菌属是目前已知的反硝化细菌中最大的类群之一，可以去除较高的硝酸盐氮[20]。此外，各地区芦苇根际相对丰度较高的还有未分类的变形杆菌（unclassifiedProteobacteria），这表明主导芦苇根际反硝化作用的可能还有一些独特的未被鉴定的反硝化菌属。

聚类分析显示地理位置相近的昌邑和寿光地区芦苇根际nosZ型反硝化细菌的群落组成相似，滨州和东营两地区的芦苇根际nosZ型反硝化细菌的群落组成相似，结合环境因子分析发现在山东省盐渍化地区，土壤的含盐量、Na+含量、含水量、总碳含量、铵盐以及pH值等环境因子均可影响反硝化微生物的群落结构，与之前的研究结果相一致[21-23]。