尹梦婕 刘国平 李怡慧 姜波 白霜 李凌绪

摘要：为了确定菵（Beckmanniasyzigachne）乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）Trp-1999-Leu突变对种子萌发的影响，采用衍生酶切扩增序列多态性法（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）从JS-26种群中分离出基因背景一致的1999位突变纯合子（1999Trp/Trp，RR）和野生型（1999Leu/Leu，SS），并在室内测定其种子萌发的动态差异，及在pH、水分、盐等胁迫下的萌发差异。结果表明，Trp-1999-Leu突变能够提高菵种子的萌发率，使菵种子在偏酸性或偏碱性条件下的萌发率降低;但能显著提高菵种子萌发对水分和盐胁迫的耐受力，水势为-0.4MPa时，RR萌发率比SS高23个百分点，NaCl浓度为80mmol/L时，RR的萌发率为SS的4.4倍。

关键词：菵;乙酰辅酶A羧化酶;Trp-1999-Leu突变;种子萌发

中图分类号：S451 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0044-06

菵（Beckmanniasyzigachne）为禾本科菵属一年生或越年生杂草，喜湿，是我国稻茬麦田主要杂草之一[1]。精唑禾草灵是乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）抑制剂类除草剂，化学结构上属于芳氧苯氧丙酸酯类（Aryloxyphenoxypropionates，APP），通过抑制禾本科杂草脂肪酸合成起到除草作用，是我国小麦田苗后选择性防治菵的主要药剂之一[2]。目前我国稻茬麦田菵已对精唑禾草灵产生了明显抗性，靶标酶ACCase特定氨基酸的突变是其重要的抗性机理之一，其中Trp-1999-Leu是菵中最新发现的抗性突变[3-5]。在除草剂存在的情况下，抗性基因可为杂草带来收益，但在没有除草剂存在时，可能带来适合度代价[6]。萌发是杂草重要的生理过程，对植物生长发育有重要影响。本试验以基因背景一致的ACCasee1999位突变纯合体菵（RR）和1999位野生型菵（SS）为材料，研究Trp-1999-Leu突变对菵种子萌发的影响，以期为菵抗性进化、抗性菵治理等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菵（JS-26）种子于2012年6月采集于江苏省丹阳市，在田间随机采集50株以上菵种子，置纸袋内，室内晾干，于4℃保存。敏感种群（SD-12）2013年6月采自山东省泰安市，采集、保存等方法同上。

1.2 种子萌發与幼苗培养

取成熟饱满、大小一致的菵种子置于铺有滤纸的9cm培养皿内，加入5mL清水，润湿种子，于光照培养箱中催芽，L∶D=12h∶12h，光照12000Lux，白昼20℃、夜晚10℃，每日换水。胚芽生长至1cm左右时移栽于装有疏松壤土的花盆中（直径15cm，高9cm），壤土采自青岛农业大学校园，未施用过除草剂。菵置于15～28℃温室内，自然光照，每两日浇水一次。用于抗性水平测定的菵每盆移入7株，生长至三叶期间苗，每盆保留5株长势一致的幼苗;用于衍生酶切扩增序列多态性（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）分析的菵每盆移入一株。

1.3 JS-26种群对精唑禾草灵的抗性水平

采用整株法测定JS-26种群对精唑禾草灵的抗性水平，以SD-12种群为对照。将精唑禾草灵（69g/L水乳剂，拜耳）配制成如表1所示的系列浓度，使用移动喷雾塔（3WP-2000，农业农村部南京农业机械化研究所）以Teejet-9503EVS型扇形喷嘴在0.28MPa下喷雾处理，喷液量450L/hm2。每盆作为一个处理，每处理重复3次，以喷施清水为对照。处理21d后，剪取地上部植株称量鲜重，使用SigmaPlot12.5（Systat）的双逻辑非线性回归模型（公式1）计算鲜重抑制中浓度（GR50）。

式中，Y为该除草剂用量下杂草地上部鲜重抑制率;C为剂量反应下限;D为剂量反应上限;X为除草剂用量;GR50为鲜重抑制中浓度;b为斜率。

根据公式2计算抗性水平（RI）。

1.4 ACCase基因克隆与测序

在菵3～4叶期采集叶片约50mg，采用CTAB法提取总DNA[7]。根据Li等[8]的方法扩增菵质体ACCase基因CT区域序列，引物为FP：5′TTTCCCAGCGGCAGACAGAT3′，RP：5′TCCCTGGAGTCTTGCTTTCA3′。PCR 反应体系（25μL）：FP（20μmol/L）1μL、RP（20μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反应缓冲液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.2μL、DNA1μL、双蒸水17.25μL。反应条件：95℃预变性3min;95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸100s，共35个循环;72℃延伸10min，4℃保温。反应结束后取PCR产物5μL，在1%琼脂糖凝胶上140V电泳30min，溴化乙锭（EB）染色后，检测目的条带。随后将扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序，测序结果用DNAMAN9.0（LynnonLLC，SanRamon，CA）进行序列比对分析。JS-26种群共采集25株进行测序比对，取样后的植株喷施精唑禾草灵观察表型，剂量为62.1ga.i./hm2。

1.5 dCAPS分析试验

参考Xu等[9]的方法进行，通过错配引物引入HindⅢ的酶切位点（A^AGCTT），分析JS-26菵质体ACCase第5996位的SNP（G/T）。使用引物为W1999LF：5′TGATTCCCACGAGCGGTCTGTTCCTCGTGCTGGGCAAAGCT3′（下划线为错配的碱基），W1999LR：5′TTGAGTTCCTCTGACCTGA3′。PCR反应体系（25μL）：DNA1μL、W1999LF（10μmol/L）1μL、W1999LR（10μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反应缓冲液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.25μL、双蒸水17.25μL。反应条件：95℃预变性3min;95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，共34个循环;72℃延伸10min，4℃保温。经3%琼脂糖凝胶电泳、EB染色确认目的条带后，取PCR反应产物5μL经HindⅢ37℃酶切2h，酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后进行分析。经内切酶消化后，野生型（SS）应该有一条390bp的条带，纯合突变型（RR）应该有一条可见的349bp条带和一条不可见的41bp条带，杂合突变型（RS）应该同时存在349bp和390bp两种带型。根据dCAPS分析结果，将SS和RR分别置于不同温室培养，收取种子，室内晾干，置4℃待用。

1.6 最适条件下RR、SS型菵种子萌发差异

分别在种子采集当天与室温储存4个月后进行试验，萌发条件同1.2。每皿放入25粒种子，重复4次。胚根或胚芽长度超过种子一半时视为萌发，每天记录萌发种子数量，并将其移出皿外，连续观察20d。

1.7 不同pH值环境下RR、SS型菵种子萌发差异

分别配制pH为4、6、8、10的缓冲液[10，11]，按1.2的方法使菵种子在不同pH值缓冲液中萌发，以去离子水（pH=6.5）为对照，每处理重复4次，20d后记录种子萌发数。

1.8 水分胁迫下RR、SS型菵种子萌发差异

配制不同浓度聚乙二醇-6000（PEG-6000）溶液，使水势分别为0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6MPa[12]，按1.2的方法萌发种子，每处理重复4次，20d后记录种子萌发数。

1.9 盐胁迫下RR、SS型菵种子萌发差异

配制浓度分别为0、10、20、40、80、160、320mmol/L的NaCl溶液，以蒸馏水作对照，萌发条件同1.2，每处理重复4次，20d后记录种子萌发数。

1.10 数据处理

试验整体重复3次，使用SPSS20.0（IBM）对3次试验数据进行方差齐性检验，若3组数据无显著性差异（P>0.05），将数据合并。使用Sigmaplot软件（Systat）对种子萌发过程进行非线性拟合。盐胁迫、水分胁迫和不同pH值条件下萌发率的差异显著性利用独立样本t检验（α=0.05）分析。

2 结果与分析

2.1 JS-26种群对精唑禾草灵的抗性水平

整株法测定结果表明（图1），JS-26种群对精唑禾草灵的GR50值为（3554.08±110.22）ga.i./hm2;SD-12种群对精唑禾草灵的GR50值为（6.29±0.13）ga.i./hm2。可见JS-26种群已对精唑禾草灵产生高水平抗性（RI=565）。

2.2 ACCase基因克隆与测序

扩增产物经电泳分析，发现在约1437bp处获得目的条带（图2）。测序比对后发现，在25株供试植株中，3株ACCase1999位氨基酸密码子为TTG，编码色氨酸（Trp），对精唑禾草灵敏感;16株1999位密码子为TGG，编码亮氨酸（Leu），6株1999位密码子为TTG/TGG，编码色氨酸/亮氨酸（Trp/Leu），均对精唑禾草灵表现出耐受性。Trp-1999-Leu突变已在日本看麦娘等杂草中得到鉴定，可使ACCase对精唑禾草灵等药剂的敏感性降低，是导致禾本科杂草对芳氧苯氧丙酸酯类除草剂产生抗性的突变位点之一[9]。

2.3 dCAPS分析

反应完成后对扩增产物进行凝胶电泳检测，可见在390bp处有明显且唯一的条带，与预期目标符合，可用于后续试验。扩增产物经HindⅢ酶切后电泳检测，结果如图3所示。泳道3在349bp处有单一条带，为突变纯合子（RR）;2、4、5、6在390bp处有单一条带，为野生型（SS）;1在349bp和390bp处均有条带，为突变型杂合子（RS）。应用此方法对JS-26种群96株菵进行检测，得到RR型（1999Leu/Leu）79株，RS型（1999Leu/Trp）1株，SS型（1999Trp/Trp）16株。

2.4 最适条件下RR、SS型菵种子萌发动态差异

由图4可知，在种子采集当天进行试验，RR型菵种子的tG50（萌发率达到50%所用时间）为14.7～16.8d，SS型菵种子的tG50为14.8～15.6d，二者无显著差异;RR型菵种子最终萌发率（73%）略高于SS型（65%），但差异不显著。室温储存明显缩短了菵种子萌发所需时间，RR型和SS型菵种子的tG50分别缩短至7.5～8.4d和7.6～9.7d，且无显著差异;储存后RR型菵种子萌发率（99%）显著高于SS型？ 草种子（87%）。可见室温储存4个月可显著缩短菵种子萌发时间，且Trp-1999-Leu突变显著提高了菵种子萌发率。

2.5 不同pH值下RR、SS型菵种子萌发差异

如表2所示，菵种子的萌发对pH值变化不敏感，在pH为4～10范围内，两基因型菵种子萌发率均在70%以上。对比两基因型菵种子萌发率发现，除pH=6.0时，RR型的萌发率均显著低于SS型。

2.6 水分胁迫下RR、SS型菵种子萌发差异

菵种子萌发对渗透压比较敏感，当渗透压为-0.1MPa时萌发率开始大幅降低，渗透压低于-0.4MPa时种子的萌发率低于50%，在-0.6MPa时萌发率低于10% （表3）。在渗透压为-0.1、-0.2、-0.6MPa时，RR型菵种子萌发率与SS型无显著差异;在渗透压为-0.3、-0.4、-0.5MPa时，RR型菵种子的萌发率显著高于SS型，分别高18、23、17个百分点。

2.7 盐胁迫下RR、SS型菵种子萌发差异

菵种子萌发对NaCl敏感，当NaCl浓度达到20mmol/L时萌发率明显降低，浓度达到160mmol/L时SS型菵种子不能萌发。RR型菵种子萌发对NaCl的耐受性更强，在NaCl浓度为20、40、80mmol/L时萌发率均显著高于SS型（表4）。

3 讨论与结论

菵是长江中下游地区稻茬麦田的主要杂草之一，已对精唑禾草灵、炔草酯等ACCase抑制剂普遍产生了抗性[13]。质体ACCase特定氨基酸的突变是菵对精唑禾草灵产生抗性的重要机理，已从菵中鉴定出了Ile-1781-Leu、Ile-1781-Val、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等抗性突变[3，4]。质体ACCase1999位氨基酸Trp突变也可能导致对ACCase抑制剂产生抗性，Trp-1999-Cys是1999位最先发现的抗性突变形式，Liu[14]、Jang[15]等将该突变导入酵母，重组酵母对精唑禾草灵和精喹禾灵产生了抗性。Liu等[5]证实菵Trp-1999-Leu突变对精唑禾草灵、精喹禾灵、唑酰草胺等具有雙环芳香基的APP类品种具有中等至高水平的抗性，对炔草酯等仅具单环芳香基的APP类品种无抗性。

为了应对不同生境的选择压力，杂草在不同空间中经常发生生态型分化，使不同地理種群在许多与适合度代价相关的位点上表现出遗传变异[16，17]。因此，控制遗传背景是适合度代价研究的重要前提。从单个群体中鉴定、分离抗性和敏感个体是常用的控制遗传背景的方法之一[18，19]。本研究采用dCAPS法从JS-26种群鉴定分离出1999位抗性纯合子（1999Leu/Leu，RR）和敏感野生型（1999Trp/Trp，SS），获得了遗传背景一致的材料，消除了其他位点的干扰。

抗性杂草种子的萌发动态会影响其在田间的发生发展[20]。本研究发现，在最适条件下，储存可使菵种子萌发时间缩短，且RR型萌发率显著高于SS型。Du等[21]研究了不同突变对菵种子萌发的影响，发现Ile-1781-Leu、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等突变对储存后菵种子萌发的tG50没有显著影响。Vila-Aiub等[22]发现ACCaseIle-1781-Leu突变使大穗看麦娘（Alopecurusmyosuroides）种子萌发的tG50升高，Ile-2041-Asn突变则对种子萌发没有影响。可见同一突变形式对种子萌发的影响在种间呈现一定程度差异。

菵种子萌发对酸碱度不敏感，pH值4～10范围内均适宜其萌发，在偏酸性（pH=4）或偏碱性（pH为8～10）条件下，RR种子萌发率显著低于SS。干旱胁迫和盐胁迫对菵种子萌发影响显著。渗透压达到-0.1MPa时菵种子萌发率迅速下降，与Du等[21]的结果一致。在本研究中，ACCaseTrp-1999-Leu突变增强了菵种子对干旱胁迫的耐受力，在渗透压为-0.3、-0.4、-0.5MPa时，RR型萌发率显著高于SS型。NaCl浓度对菵种子萌发也有一定影响，浓度达到20mmol/L时，菵种子萌发率出现明显下降。与SS型相比，RR型对盐胁迫的耐受性更高，说明ACCaseTrp-1999-Leu突变提高了菵种子萌发对盐的耐受力。Du等[21]研究了ACCase不同突变在干旱胁迫和盐胁迫下对菵种子萌发的影响，发现Ile-1781-Leu突变可提高干旱胁迫下菵种子的萌发率，在野燕麦（Avenaludoviciana）上的研究则表明Asn-2041-Ile突变不会影响种子萌发对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性[23]。

本试验表明菵ACCaseTrp-1999-Leu突变降低了菵种子对酸碱的耐受性，但增强了对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性，对抗性菵的分布可能会产生一定影响。