刘子豪 来晓磊 刘红旭

2019年12月以来，全球各国陆续出现新型冠状病毒肺炎病例，并进一步蔓延，世界卫生组织已宣布新型冠状病毒肺炎为大流行病[1]。截至2020年6月16日8时，根据美国约翰霍普金斯大学发布的实时统计数据显示[2]，全世界共有200余个国家和地区累计确诊病例超过800万例，累计死亡超过43万例。

国家卫生健康委及国家中医药管理局先后颁布诊疗方案[3]，针对本病的不同证型辨证施治，并多次提出中医“治未病”要广泛参与到此次疫情防治之中。中医学认为在未病之时如果能够采取一定的手段，可以对预防疾病起到一定的作用。《素问·四气调神大论篇》云“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱”[4]，提出“治未病”的概念。《素问·刺法论篇》云“正气存内，邪不可干”，强调“正气”在预防疾病中的重要地位。目前针对本次新型冠状病毒肺炎的中医认识较为统一[5-7]，疾病归属于“疫疠”范畴，其病因属性为“湿毒之邪”，病机为“湿、毒、瘀、闭、虚”，病位在肺、脾。由此推测，以扶正、化湿、解毒为立法的中药处方可以起到预防新冠肺炎的作用。

众多国医大师也积极参与此次疫情防治，笔者前期对国医大师已公布的预防处方进行总结、分析，周仲瑛、孙光荣、唐祖宣、李佃贵、金世元、王琦、熊继柏、刘祖贻等国医大师开具了预防用方，以益气、化湿、清解为主要立法，其中黄芪、藿香、金银花为核心处方用药[8]。《素问·评热论篇》云“邪之所凑，其气必虚”，正气是抵御外邪的核心，正气充足则外邪不易伤人。北京市第5版新冠肺炎中医药防治方[9]中成人代茶饮方使用了黄芪、藿香；儿童代茶饮方使用了金银花。蒋燕君等[10]对中国各地公布的预防处方进行数据分析同样发现黄芪为预防新冠肺炎的核心用药。此次新冠肺炎属“湿毒疫”[11]，化湿、解毒是主要预防和治疗方法。方中黄芪益气扶正，藿香芳香化湿，金银花清热解毒，三药联用可扶正祛邪，直中病机，从而起到未病先防之用。

常态化疫情防控之下，目前尚无特效药物问世，疫苗仍处于临床试验阶段，在做好个人防护的同时，能否通过“中医治未病”的参与起到预防新型冠状病毒肺炎的作用值得临床研究。本研究拟通过网络药理学筛选出黄芪、藿香、金银花3味药物的作用靶点，预测其核心活性化合物，并运用分析软件对药物—化合物—靶点以及靶点—信号通路进行分析，探索其预防新型冠状病毒肺炎的潜在作用机制，为抗新冠肺炎药物开发和临床防治应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药物化学成分的收集

应用中药系统药理学数据库及分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[12]，以“黄芪”“藿香”“金银花”为关键词检索药物相关活性化合物。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18、药物半衰期(drug half-life，HL)≥10为筛选条件，最终得到符合条件的化合物。

1.2 靶点基因名的校正及药物—化合物—靶点网络的构建

应用中药系统药理学数据库及分析平台获取黄芪、藿香、金银花3味药物主要活性化合物的关联靶点，应用UniProt数据库[13](http://www.uniprot.org)校正靶点基因名称。以“coronavirus disease 2019” “novel coronavirus pneumonia”等为关键词在GeneCards网站(http://www.genecards.org)检索新型冠状病毒肺炎相关基因，在String在线数据库(http://www.string-db.org)导入靶点基因，设定属性为人类。收集化合物靶点基因与新型冠状病毒肺炎基因的共同靶点，并绘制韦恩图。结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行药物—化合物—靶点网络构建，实现可视化。

1.3 靶点蛋白互作网络的构建

利用String在线数据库对共同靶点的进行蛋白互作分析，将靶点信息导入String数据库，物种选择“Homo sapiens”，以蛋白互作综合得分>0.4为筛选条件，获取共同靶点蛋白互作信息及可视化网络图。

1.4 靶点通路分析

应用R(https://www.r-project.org/)语言软件及Bioconducter生物信息软件包(https://www.bioconductor.org/)，导入靶点基因，进行靶点基因本体功能及基因组数据库通路富集分析，保留P<0.05的结果。得到黄芪—藿香—金银花有效化合物作用靶点的主要生物功能和过程以及相关通路，选取前20个条目进行可视化处理。最后运用Cytoscape软件构建靶点—信号通路网络图。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

通过中药系统药理学数据库及分析平台检索到黄芪、藿香、金银花中化合物417个，其中黄芪87个、藿香94个、金银花236个；以OB≥30%、DL≥0.18且HL≥10为阈值筛选条件，得到活性成分24个。其中MOL000098-quercetin为黄芪、藿香、金银花共有化合物；MOL000422-kaempferol为黄芪、金银花共有化合物。删除重复项共21个活性成分。见表1。

2.2 疾病相关靶点筛选

从中药系统药理学数据库及分析平台中获取活性化合物相关靶点181个，从Genecards数据库中筛选得到新型冠状病毒肺炎相关靶点259个，两者相映射得到42个共同靶点，并绘制韦恩图。结果见表2、图1。

表1 黄芪、藿香、金银花化合物基本信息

续表

表2 黄芪、藿香、金银花和新型冠状病毒 肺炎重合靶点信息

2.3 药物—化合物—靶点网络分析

将已筛选的有关活性化合物及靶点构建表格，导入Cytoscape软件，对不同化合物进行属性命名，构建药物—化合物—靶点网络图，结果见图2。其中粉色代表疾病新型冠状病毒肺炎，绿色代表黄芪、藿香、金银花3味药物，黄色代表活性化合物，蓝色代表靶点。药物活性化合物中等级(degree)值排列前5位的分别是：槲皮素(quercetin，MOL000098，degree值为152)、山奈酚(kaempferol，MOL000422,degree值为39)、木犀草素(leteolin，MOL000006，degree值为36)、尼泊尔鸢尾异黄酮(irisolidone，MOL005916，degree值为16)、芒柄花黄素(formononetin，MOL000392,degree值为14)；主要靶点中degree值排列前5位的分别是PTGS2(degree值为18)、PTGS1(degree值为15)、PPARG(degree值为14)、NOS2(degree值为10)、MAPK14(degree值为7)。

图1 黄芪、藿香、金银花和新型冠状病毒肺炎

2.4 靶点蛋白互作网络分析

在String在线数据库上输入42个共同靶点，分析后得到蛋白互作网络图，见图3。该网络图含有42个靶点及513条边，平均度值为24.4。其中，各节点表示作用靶点，每条边表示各靶点之间的相互作用关系，边数越多表示该节点对应的作用靶点越重要。

2.5 靶点通路分析

基因本体论生物功能主要包括生物过程(biology process，BP)、细胞组成(cell component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3个部分。将共同靶点进行基因本体论生物功能分析，以P<0.05为筛选条件，共获得基因本体论生物功能1470条，根据生物过程、细胞组成和分子功能分别选取前20个条目(细胞组成满足条件的仅10条)进行可视化分析，见图4～6，图中纵坐标表示条目名称，横坐标表示富集个数。图4显示共同作用靶点生物过程集中在细菌反应、脂多糖应答、细菌来源分子反应等；图5显示共同靶点在细胞组成中集中于膜筏、膜微区、膜区等；图6显示共同作用靶点分子功能集中于细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等。

图2 黄芪—藿香—金银花配伍预防新冠肺炎药物—化合物—靶点网络关系图

图3 黄芪—藿香—金银花配伍预防新冠肺炎靶点蛋白互作网络关系图

注：纵坐标表示条目名称；横坐标表示富集个数。

注：纵坐标表示条目名称；横坐标表示富集个数。

注：纵坐标表示条目名称；横坐标表示富集个数。

2.6 靶点的基因组数据库通路分析

对42个共同靶点进行基因组数据库通路富集分析，以P<0.05为筛选条件，对排列前20位的通路进行可视化分析，得到通路富集分析柱状图，见图7。图中纵坐标表示通路名称，横坐标表示富集的个数。共同靶点主要富集于AGEs-RAGE信号通路、甲型流感通路、白介素-17信号通路、人巨细胞病毒感染、肿瘤坏死因子信号通路、美国锥虫病通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路等。

2.7 靶点—通路网络构建

将获得的基因组数据库通路条目和共同靶点信息导入Cytoscape软件，绘制靶点—通路网络图，见图8。图中蓝紫色图标代表相关靶点，浅绿色图标代表相关通路。其等级值排列前5位的核心靶点为MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA。

注：纵坐标表示通路名称；横坐标表示富集的个数。

注：蓝紫色图标代表相关靶点；浅绿色图标代表相关通路。

3 讨论

《黄帝内经·素问》云“疫疠乃天之邪气，若吾身正气内固，则邪不可干，故不相染也”，“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”。正气是人体抵御外邪的重要部分，笔者前期对国医大师公布的预防处方分析，多以益气、化湿、清解为核心思路，黄芪、藿香、金银花为核心用药。本研究采用网络药理学的研究方法，应用中药系统药理学数据库及分析平台对黄芪、藿香、金银花三味中药的有效活性化合物进行筛选，应用GeneCards数据库对疾病靶点进行筛选，构建活性成分—靶点网络，应用String在线数据库构建蛋白互作网络，并应用Bioconducor程序包进行靶点基因本体及基因组数据库通路富集分析，构建靶点—信号通路网络。本研究共筛选出活性化合物21个，相关靶点181个，与新型冠状病毒肺炎重合靶点42个，基因组数据库通路144个，说明黄芪—藿香—金银花配伍预防新型冠状病毒肺炎具有多成分、多靶点、多通路的特点。

化合物中活性最强的是槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊尔鸢尾异黄酮和芒柄花黄素。槲皮素具有抗病毒、抗炎、抗感染、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、免疫调节等多种作用，并且对肺、支气管损伤具有保护作用[14-15]。汤海等[16]研究表明槲皮素可通过抑制Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3 (Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路激活而改善气体交换功能，抑制炎性介质的释放，从而减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。魏萍等[17]研究发现槲皮素可以降低转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白和肿瘤坏死因子-α等表达，抑制大鼠肺泡细胞凋亡，降低大鼠肺组织炎症和纤维化损伤。万巧凤等[18]报道槲皮素可通过抑制细胞凋亡效应酶Caspase-3活性在体外发挥抗甲型流感病毒作用。Kumar P等[19]实验发现槲皮素可通过减少氧化应激诱导进而保护流感病毒感染的小鼠肺组织。山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫等多种药理作用[20]。赵妍[21]研究发现山奈酚可以减轻脂多糖导致的小鼠急性肺损伤。DONG X等[22]发现山奈酚可通过降低丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子-κB等通路的活性来抑制肿瘤坏死因子-α、白介素-6、白介素-10、、白介素-1β、血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1的表达水平，发挥抗炎作用。张伟贤等[23]发现山奈酚可通过抑制Jun氨基末端激酶磷酸化，降低肝细胞氧化应激, 保护线粒体功能，抵抗DNA断裂诱发细胞凋亡，从而减轻肝细胞损伤。木犀草素具有抗氧化、抗菌、抗炎、神经保护和抗过敏的特性[24]。有研究[25-26]发现木犀草素可以通过减少活性氧和活性氮的生成，影响花生四烯酸的代谢和多种炎性信号通路，抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达，从而减轻炎症反应。邓东沅等[27]发现体外环境下，甲型流感病毒感染A549细胞激活凋亡通路后,木犀草素能通过降低相关基因表达,干预细胞凋亡，发挥抑制流感病毒的作用。芒柄花黄素具有抗炎、调节代谢、调节雌激素、降压等作用[28-29]。杨雅静[30]研究发现芒柄花黄素可提高小鼠固有免疫细胞的吞噬功能及溶菌酶的杀菌活性，提升小鼠体液免疫能力。多位学者[31-36]应用网络药理学研究发现不同中药处方如清肺排毒汤、藿香正气口服液、连花清瘟胶囊、达原饮中均含有槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊尔鸢尾异黄酮等有效活性成分，研究者应用分子对接技术发现上述成分与2019新型冠状病毒3CL水解酶的结合能同目前临床推荐应用的新型冠状病毒肺炎治疗用药洛匹那韦、瑞德西韦等药物基本相似。

靶点—信号通路网络图中，等级值前5位的靶点分别是MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA。MAPK1和MAPK8同归属于MAPK家族成员，在包括氧化应激、DNA损伤、癌症发展和病毒感染在内的环境应激下被激活[37]。WANG C等[38]研究发现细胞可通过蛋白调控抑制MAPK，从而抑制病毒的有关活动。RELA是核因子-κB转录因子的一个亚基，其通过诱导免疫细胞、炎症细胞基因的表达，参与炎症反应的调控,与中性粒细胞密不可分。活化的中性粒细胞能够分泌γ-干扰素、白介素-6等炎性因子，升高肿瘤坏死因子-α等趋化因子，能加重炎症反应[39]。TIAN B等[40]研究也发现RELA与病毒引起的呼吸道炎症有关。陈民利等[41]研究发现RELA在急性肺损伤大鼠肺组织中表达增加，提示抑制RELA表达可能对急性肺损伤有改善作用。TPRKCB和PRKCA属于蛋白激酶C家族，在细胞的代谢、凋亡、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。Kennedy SG等[42]研究发现，蛋白激酶C的激活能抑制细胞凋亡。

靶点基因本体富集分析结果中，生物过程集中于脂多糖应答、生物刺激反应、细胞凋亡信号通路的调控、氧化应激反应等方面，分子功能集中于细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、趋化因子结合、肿瘤坏死因子结合等方面。推测这些生物过程和分子功能在黄芪—藿香—金银花预防新型冠状病毒肺炎中起到了关键的作用。

基因组数据库通路富集分析发现主要涉及的通路有AGEs-RAGE信号通路、甲型流感通路、白介素-17信号通路等，涉及病毒、细菌、免疫调节、炎症反应等多个方面。晚期糖基化终末产物受体信号通路可激活核因子-κB，使其进入细胞核，在核内同多种基因启动子序列特异性结合，可引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子等的表达和释放，引起慢性细胞活化和组织损伤[42]。白介素-17和肿瘤坏死因子信号通路都是参与炎症反应和免疫调节的重要通路。由此推测黄芪—藿香—金银花可能通过作用于上述通路，调节病毒相关通路，调控细胞凋亡和炎症反应，从而达到预防新型冠状病毒肺炎的效果。

综上所述，黄芪—藿香—金银花配伍其主要有效活性成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊尔鸢尾异黄酮和芒柄花黄素，可能通过作用于MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA等核心靶点，调控AGEs-RAGE信号通路、甲型流感通路、白介素-17信号通路等，从而预防新型冠状病毒肺炎。网络药理学研究的局限性在于它不能得出任何药效学的结论，其重要意义在于为寻找可能的有效活性成分、关键通路和作用靶点进行科学验证。希望本研究为中医药防治新型冠状病毒肺炎及中药新药的开发提供有益的思路。