吴 凡,任名栋,陈非洲,吴庆龙,史小丽,*

1 中国科学院南京地理与湖泊研究所,南京 210008 2 中国科学院大学,北京 100049

抚仙湖位于云南省中部,北纬24°21′28″—24°38′00″,东经102°49′12″— 102°57′26″之间[1],呈主轴南北向的倒挂葫芦型,跨澄江、江川和华宁三县。湖泊面积211 km2,平均水深87.0 m,最大水深达157.3 m,是仅次于长白山天池的中国第二大深水湖泊。抚仙湖蓄水量占云南9大高原湖泊的72.8%,占全国淡水湖泊的9.16%,是我国重要的淡水资源[2]。抚仙湖为半封闭的山间盆地型湖泊,湖水主要靠降水和山间小河汇集补充[3],水质清澈,为贫营养湖泊[4]。近年来由于人类活动的影响[5],抚仙湖水质不断发生变化,污染物浓度增加,营养水平提高,水体透明度下降,水质达I类水的面积占全湖的比例不断下降[6]。

超微型浮游藻类(autotrophic picophytoplankton,APP)是指粒径在0.2—3 μm的微型藻类,包括超微真核藻(photosynthetic picoeukaryotes,PPEs)和超微蓝藻(picocyanobacteria,PCY)[7],广泛分布于海洋和淡水生态系统中,是水生生态系统中重要的初级生产者[8- 10],尤其是在贫营养湖泊中,是主要的碳源固定者[11]。由于超微藻粒径较小,受传统研究方法的限制,对其的认知还非常有限。近年来,随着流式细胞术和分子生物学技术的广泛应用,超微藻的研究方法得到突破性进展,对其关注度也越来越高。国内已有关于超微藻的研究集中在富营养湖泊,周建等研究了大型通江湖泊鄱阳湖超微型浮游藻类的空间分布特征[12]；李胜男等研究了大型富营养化浅水湖泊太湖、巢湖超微真核藻的时空分布特征和主要环境影响因子[13]；史小丽等对长江中下游的20多个中营养型和富营养型湖泊超微真核藻的群落结构进行研究[14]。目前国内关于贫营养湖泊超微藻的认知几乎是空白[15]。抚仙湖作为山间盆地型贫营养深水湖泊,必然具有不同于富营养化浅水湖泊的超微藻群落结构。超微藻作为贫营养湖泊初级生产力的主要贡献者,对其组成和分布的研究有助于更全面的认识抚仙湖生态系统结构和功能。本论文结合流式细胞术和高通量测序技术,系统研究了抚仙湖超微藻群落结构组成的空间分布特征及其影响因子。

图1 抚仙湖采样点位分布图(·代表采样点位) Fig.1 Distribution of sampling sites in Lake Fuxian (·represent sampling sites)P：表层采样点位；D：垂直采样点位

1 材料与方法

1.1 采样地点及处理

2016年7月对抚仙湖进行采样,共35个采样点,采取表层0.5 m的水样,同时对北部和南部(D1、D2)最深点进行分层采样(图1)。D1点采集水下0.5 m、20 m、40 m、60 m、100 m、120 m深处的水样,编号分别为D1_0、D1_20、D1_40、D1_60、D1_100、D1_120；D2点采集水下0.5 m、20 m、40 m、60 m深处的水样,编号分别为D2_0、D2_20、D2_40、D2_60。选择表层35个点位的样品对超微藻丰度水平分布特征分析,选择南北通透的P31、P32、P33、D1、D2五个点位进行超微真核藻群落结构水平分布分析,选择北部和南部最深点(D1和D2)分层点位的样品对超微藻丰度和超微真核藻群落结构的垂直分布特征进行分析。用采水器采集不同深度的湖水,置于用原位湖水润洗后的白色塑料水桶内,带回实验室。部分水样用25%的戊二醛固定(最终浓度为2%)后,用液氮速冻,带回实验室用于后续的流式细胞仪分析。

1.2 参数测定方法

1.2.1水样理化参数测定

1.2.2流式分析

将戊二醛固定的水样在常温下自然解冻,水样混匀后用300目筛绢过滤(以免较大的颗粒物堵塞流式细胞仪的喷嘴),用流式细胞仪(BD FACSJazz Cytometer,USA)计数超微藻丰度[20]。因超微真核藻富含叶绿素,而超微原核藻富含藻蓝素或藻红素[21],结合荧光信号、前向散射光和侧向散射光,通过流式细胞仪区分原核超微藻和真核超微藻,并分别计数和分选。

1.2.3目的片段扩增及测序

用Qiagen公司提供的DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue Kit 提取分选的超微真核藻样品DNA用于目的片段扩增。真核超微藻的扩增引物选择EK-NSF573 5′-CGC GGT AAT TCC AGC TCC A- 3′和Ek-NSR951 5′-TTG GYR AAT GCT TTC GC- 3′ 。

扩增反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s,循环30次；72 ℃延伸10 min。扩增后的产物进行MiSeq上机测序。

1.2.4序列优化及OTU聚类

测序获得的原始数据,使用Cutadapt软件去除末尾的引物序列,然后使用fastx去除末尾质量低于Q15的碱基后用FLASH软件对数据进行合并,得到有效序列。最后丢弃后引物错配两个碱基以上的、长度短于200 bp、总碱基错误率高于1的序列,得到优化后的序列。最后使用UPARSE软件将序列按照指定的相似度聚类为OTU(Operational Taxonomic Unit),其中真核样品的相似度为97%。最后根据Silva123数据库对聚类后的OTU注释。

1.2.5数据分析与处理

运用Excel、Origin 8.5、R Studio进行数据分析和图表的绘制。用ArcGis10.2采用克里格(Kriging)插值法做超微藻丰度的空间分布情况图。

2 结果

2.1 抚仙湖超微藻对总浮游藻类的贡献

通过逐级过滤法测定抚仙湖超微藻在总浮游藻类生物量中的贡献。抚仙湖北部最深点D1超微藻Chla浓度在水下20—30 m之间达到最大值,为0.75 μg/L；南部最深点D2超微藻浓度在水下10 m处达到最大值,为1.25 μg/L。超微藻对总浮游藻类生物量的贡献率分别在水下50 m和30 m最大,南部最深点贡献率的平均值约为40%,明显高于北部最深点。并且受温跃层等因素的影响,北部最深点超微藻的贡献率在不同深度波动较大(图2)。

图2 抚仙湖超微藻Chla和超微藻对总浮游藻类Chla贡献率垂直分布Fig.2 The vertical distribution of picophytoplankton Chla concentration and its contribution to total phytoplankton biomass (%) in Lake Fuxian

2.2 抚仙湖超微藻的丰度空间分布特征

2.2.1超微藻丰度的水平分布特征

抚仙湖夏季超微藻平均丰度为(8.58±3.25)×103个/mL,水平空间分布表现为：在抚仙湖北部和南部沿岸带丰度最高,北部梁王河(P2)丰度最高,为11.91×103个/mL,从北向南丰度逐渐降低,在北部最深点达到最低,丰度为4.82×103个/mL,随后又逐渐升高,在最南端(P28)丰度达到最高,丰度为10.33×103个/mL。超微真核藻和超微蓝藻的丰度空间分布和总超微藻的类似,均表现为：在最北部的断面(P2)丰度相对北部其他湖区较高,在北部最深点丰度最低,超微真核藻和超微蓝藻的丰度分别为1.33×103个/mL和3.49×103个/mL,在最南部断面(P28)丰度达到最大值,丰度分别为2.14×103个/mL和8.19×103个/mL(图3)。

图3 抚仙湖超微藻丰度空间分布Fig.3 The spatial distribution of picophytoplankton abundance in Lake Fuxian

2.2.2超微藻丰度的垂直分布特征

抚仙湖北部最深点D1处水深157.3 m,南部最深点D2处水深78.0 m。流式细胞仪计数的结果表明：北部最深点丰度总体上低于南部最深点。北部D1点不同深度总超微藻丰度的平均值为(7.49±2.18)×103个/mL,超微蓝藻和超微真核藻丰度的平均值分别为(5.83±1.97)×103个/mL和(1.66±0.36)×103个/mL。在水下10 m处超微藻丰度达到最大值,随着深度的增加超微藻丰度有所下降,超微蓝藻和超微真核藻的变化趋势基本一致。南部D2点超微藻丰度的平均值为(11.48±2.67)×103个/mL,超微蓝藻和超微真核藻丰度的平均值分别为(9.05±2.06)×103个/mL和(2.42±0.65)×103个/mL。同样也是在水下10 m处超微藻丰度值最高,随着深度的增加丰度值逐渐下降,超微真核藻和超微蓝藻的变化趋势也大致相同,但是超微真核藻的丰度大大低于超微蓝藻(图4)。

图4 抚仙湖超微蓝藻和超微真核藻垂直分布Fig.4 The vertical distribution of picophytoplankton in Lake Fuxian

2.3 超微藻丰度和环境因子之间的关系

将表层35个点位的数据和南北部最深点不同深度的数据通过方差膨胀因子(VIF)分析和建模得到超微藻丰度和环境因子之间的相关关系。结果表明：水体浊度、pH以及总磷对超微真核藻丰度有显著影响,其中浊度与超微真核藻之间的相关性最大；超微蓝藻的丰度受总磷影响较显著,其次是pH(图5)。

图5 超微藻丰度和环境因子之间的关系Fig.5 The relationship between the abundance of picophytoplankton and environmental factors

2.4 超微真核藻群落组成

淡水湖泊超微蓝藻主要为聚球藻Synechococcus,而超微真核藻多样性更高,群落结构更为复杂,因此本文主要对超微真核藻的多样性进行研究。对分选出的超微真核藻样品进行高通量测序和分析,共获得88个OTUs,由表1可以看出,抚仙湖超微真核藻中不等鞭毛类的金藻纲(Chrysophyceae)占比最高,达到57.11%,随后是囊泡虫门的甲藻纲(Dinophyceae) 和硅鞭藻纲(Dictyochophyceae),硅藻纲(Bacillariophyceae)和绿藻纲(Chlorophyceae)占比相对较少。

表1 抚仙湖超微真核藻的分类特征

2016年7月抚仙湖的测序样品中,序列丰度最高的前10个OTUs主要分布在不等鞭毛类的金藻纲Chrysophyceae(OTU6、OTU31、OTU183、OTU193、OTU11)、硅鞭藻纲Dictyochophyceae(OTU4、OTU2),甲藻纲Dinophyceae(OTU1、OTU24)以及硅藻纲Bacillariophyceae(OTU42)。但是属于甲藻纲的2个OTUs以及部分不等鞭毛类尚未确定到属水平。

将北部最深点、南部最深点不同深度和表层南北通透的5个点位的88个OTUs进行群落组成分析,其中将占比不足1%的物种归到others类,图6为超微真核藻群落组成呈现出的空间差异。北部最深点(D1)不同深度的水体有明显的差异：表层(D1_0)点主要是甲藻纲(Dinophyceae)、金藻纲(Chrysophyceae)和硅鞭藻纲(Dictyochophyceae)；20 m深处(D1_20)主要是金藻纲和硅鞭藻纲,绿藻纲(Chlorophyceae)的占比增加；40 m深处(D1_40)硅鞭藻纲和金藻纲序列丰度增加,绿藻纲序列丰度减少；而在60 m深处(D1_60),绿藻纲丰度相对较高,硅鞭藻纲在该水层深度最少；随着采样深度的增加,硅藻纲占比上升,金藻纲占比降低。但是在南部最深点D2,不同采样深度的样品间超微真核藻的群落组成差异较小,优势种都是金藻纲。全湖表层样品中超微真核藻的群落组成在不同点位也有较小的差异,位于南部湖区的D2_0和P31主要以金藻纲(Chrysophyceae)为主；偏湖区北部的D1_0、P32、P33三个点超微真核藻群落组成差异较大,P32和P33主要由金藻纲和硅藻组成,其次是绿藻纲和硅鞭藻纲。具体的超微真核藻的群落组成空间分布如表1所示。三个分组中,超微真核藻的群落组成差异不大。在D1、D2以及表层水体的5个点位中,超微真核藻主要包括不等鞭毛类、甲藻纲和绿藻纲。三个分组中分别有37、32、42个OTUs属于自养不等鞭毛类,其中金藻纲在所有超微藻中占绝对优势,其序列数占总序列数的比例分别为9.9%、34.3%、21.8%。

表2 抚仙湖中丰度最高的前10个OTUs及其分类信息

图6 抚仙湖超微真核藻群落组成空间差异Fig.6 The spatial distribution of taxonomic composition of the PPEs in Lake Fuxian

3 讨论

3.1 超微藻对湖泊浮游藻类生物量和初级生产力的贡献

本研究中抚仙湖超微藻的丰度低于104个/mL,远远小于热带寡营养湖泊[16]和亚热带富营养湖泊[13]的105个/mL的丰度。超微藻对淡水总产量的贡献模型基于Petersen对新西兰8个湖泊的研究结果[22],Chla浓度处于0.57—103 μg/L。超微型浮游藻类对总碳固定的贡献率与湖泊的营养状况之间存在负相关。本研究中,抚仙湖的TN和TP的浓度较低,超微藻Chla对总浮游藻类Chla的平均贡献率为67.3%,远远高于富营养湖泊太湖和巢湖[13]。

超微藻粒径小,比表面积大,具有很高的营养盐吸收速率和光捕捉效率[23-24],在低营养水平水体中,受到营养分子扩散限制的程度要低于微小型藻类[25],因此超微藻在总浮游藻类中的比例随着水体营养盐水平的降低而增加[24-26],超微藻对初级生产力和生物量的贡献在贫营养湖泊中更重要[27-28]。例如,在中营养湖泊中,超微藻对总初级生产力的贡献率为16%—58%[29],而在太平洋和大西洋营养水平较低的水域,超微藻对总初级生产力的贡献率达到了60%—80%[30]。此外,由于超微藻具有较高的最大光合速率和光利用参数,比微小型浮游藻类更能适应冬季低温低光照的环境[24]。

3.2 超微蓝藻在抚仙湖占据优势

本研究结果表明,抚仙湖超微蓝藻的优势度要高于超微真核藻,而在富营养化湖泊中通常超微真核藻占优势。抚仙湖超微蓝藻的主要种群是聚球藻Synechoccocus[28]。超微蓝藻细胞的原核结构为它们提供了维持代谢的最低成本,这也是它们在贫营养状态下繁殖的主要原因[31]。马焦雷湖为期四年的超微型浮游藻类群落组成的调查研究发现,随着营养盐负荷的下降,该湖超微蓝藻的丰度逐渐上升[32]。超微型浮游藻类的群落组成很大程度上取决于湖泊的类型和形态,湖泊垂直结构的稳定性和高水文保留时间有利于超微蓝藻的生长,尤其是深度较深、面积较大的湖泊通常是超微蓝藻的优选环境[32]。

3.3 抚仙湖超微真核藻的遗传多样性

超微真核藻和超微蓝藻在湖泊中具有不同的时空分布格局,主要是因为它们对营养和光照的要求以及潜在的生长速率都不同[31]。目前为止,我们对寡营养湖泊超微真核藻的群落组成了解甚少,有研究表明金藻和隐藻是贫营养湖泊派帕文湖主要的超微真核藻类群[33]。该研究采用通用真核生物引物对逐级过滤的滤膜样品进行18S rRNA基因克隆和测序,所得数据库中超微真核藻序列比较低,可能偏向异养生物,会大大低估超微真核藻的多样性。基于超微真核藻的自发荧光信号,流式细胞仪可以将其分选出来,再进行测序,这种方法使得超微真核藻在数据库中的比例达到了60%以上,已被证明是研究超微真核藻群落组成方法学上的重要进步[34]。

富营养化湖泊中的超微真核藻主要由绿藻和硅藻组成[14,17,34]。抚仙湖研究结果表明,金藻纲、绿藻纲、甲藻纲的序列数相对其他真核藻较高,其中金藻纲的多样性最高,具有32个OTUs,随后是绿藻纲,有13个OTUs。因此,不同营养水平湖泊具有不同的超微真核藻群落结构。抚仙湖超微真核藻的优势种群为绿藻、硅藻和金藻,Jaccard相似性系数与其它一些贫营养湖泊(如泸沽湖、密歇根湖、苏必利尔湖等)不同[14,34-35],说明抚仙湖具有独特的超微真核藻群落结构。抚仙湖超微真核藻OTU序列丰度最高的是Dinobryonsociale。研究表明,Dinobryon存在于贫营养湖泊中,对低浓度的无机磷酸盐具有高亲和力,还有吸收有机聚合磷酸盐的能力[36-37],此外两个丰度排在前面的OTU属于甲藻纲Dinophyceae,甲藻纲广泛存在于东阿尔卑斯山区的北部和南部的高山贫营养湖泊中[38]。

4 结论

(1)水平方向上,受周围人类活动、东部磷矿区等因素的影响,抚仙湖超微藻丰度值南部湖区高于北部,湖岸带高于湖心区。超微真核藻和超微蓝藻丰度的水平格局基本一致,但在数量上,超微蓝藻细胞数占绝对优势。

(2)垂直方向上,随着水体深度的增加,超微藻丰度以及对总浮游藻类生物量的贡献率呈下降的趋势。在水下10 m处,超微藻丰度达到最大值。超微藻对总浮游藻类生物量的贡献率则分别在北部最深点水下50 m和南部最深点30 m时最大,分别为51.3%和48.7%。光照和温跃层是影响超微藻垂直分布差异的重要环境因子。

(3)抚仙湖超微真核藻分布在不等鞭毛类的金藻纲、甲藻纲、硅鞭藻纲和绿藻纲等类群中,金藻纲是主要的超微真核藻。在空间上,抚仙湖不同湖区和不同深度超微真核藻的群落组成也存在差异：表层水中以金藻纲、硅藻纲、甲藻纲为主；而在深层水中超微真核藻的多样性降低,金藻纲成为优势类群。

致谢：感谢中国科学院抚仙湖高原深水湖泊研究站提供的帮助。