刘 娟 郑国栋 陈 杰 邹曙明

(1.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306;2.上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心,上海201306;3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306)

水体中的溶氧水平是生物生存、生长、发育和能量代谢等过程中必不可少的因素。水体中的溶氧含量易受到外界因素(如天气状况)影响[1],当水体氧含量不足以满足鱼体正常生存的需求时,鱼体就会出现缺氧应激反应[2],缺氧应激会影响鱼体生长、发育、繁殖和代谢等方面,长时间的低氧胁迫或胁迫强度过大时,甚至会引起个体死亡[3,4]。

缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors,HIFs)是缺氧应答反应的主要调控因子,在维持动物体内氧稳态平衡的过程中起着至关重要的作用[5]。在常氧条件下,脯氨酸羟基化酶家族(Prolyl hydroxylases,PHDs)在特定脯氨酸残基位点羟基化HIF-1和HIF-2,并通过泛素蛋白酶系统迅速使HIF-1和HIF-2蛋白发生降解[6—8]。而在低氧条件下,PHDs的酶活性受到抑制,TET1与PHD2竞争与HIF-2结合,导致PHD2降低HIF-2的羟基化,增强低氧信号转导通路[9,10]。TET(Ten eleven translocation)1属于α- 酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid,α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶大家族,是一种5mC羟基化酶,是DNA去甲基化过程中不可或缺的一种酶[11],在调控胚胎干细胞的发育,肿瘤、血液系统等有重要作用。通过在斑马鱼(Danio rerio)和小鼠(Mus musculus)的研究,肖武汉团队研究表明,DNA羟甲基化酶基因TET1参与缺氧应答反应,并在缺氧应答反应中有重要作用[9]。Tsai等[12]研究表明,TET1是由低氧诱导因子(HIF-2)调控的。TET1作为HIF-1α的辅助激活物,增强HIF-1的转录活性[12]。Chen等[13—15]研究表明,TET1参与了缺氧反应的改变并参与了肿瘤的发生。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖经济鱼类,草食性,俗称武昌鱼。团头鲂与其他鲤科鱼类相比,具有不耐低氧的特点,在运输和养殖过程中,容易因缺氧而引起应激反应,甚至死亡,影响了其养殖产量的提高。因此研究缺氧应答相关基因,探究团头鲂缺氧应答基因的相关功能就显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用材料均取自上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心,受精卵为团头鲂(F4代)卵细胞人工体外受精,将受精卵培养于培养皿(直径15 cm)约100—120颗,在室温(22±1)℃,溶氧量(7.0±0.5)mg/L下培养,使用经24h曝气的自来水,每4—5h换水。每隔4h(0—40h)固定一批胚胎,按照RNA保存液使用说明操作,保存于-80℃至使用。原位杂交所用胚胎去卵膜后于4%磷酸缓冲液4℃、12h,后转至甲醛中-20℃保存;取体质量为150—160 g的F5代团头鲂暂养在实验室的塑料水族箱(35 cm×55 cm×45 cm)中,暂养7d,温度(24.5±1.0)℃、溶氧量(7.0±0.5)mg/L,每2日换水(24h曝气的自来水)1/3,每日投喂两次(8:00和16:00),保持自然光照。

1.2 实验设计与样品采集

取30尾F5代团头鲂幼鱼于3个自动循环系统的水箱(50 L)各10尾,共设2个溶氧水平,低氧处理方法参考Zhang等[16],根据预实验设其中两组为低氧组(1.5±0.5)mg/L;对照组(7.0±0.5)mg/L,急性缺氧处理4h,各实验组随机取3尾鱼,MS-222(100 mg/L)麻醉,取组织(心、肝脏、脑、鳃、肌肉、皮肤、眼睛、肾和脾脏)-80℃保存,而后将缺氧处理组恢复至常氧(7.0±0.5)mg/L,24h后取组织-80℃保存,每个实验组3个重复。团头鲂极不耐低氧,胚胎在低氧条件下极易死亡,故根据预实验,胚胎低氧处理组设两个实验组,每组200颗胚胎,低氧组(3.5±0.5)mg/L;对照组(7.0±0.5)mg/L,低氧处理6h,低氧处理组在6、12、18、24及30 hpf取样,放入RNA保存液,对照组也及时在对应的各个发育阶段取样,每组设置3个重复,每个重复200颗胚胎。水体溶氧水平通过氮气和增氧棒的气阀通气大小来控制,并及时用溶氧仪检测氧含量。

1.3 TET1基因扩增及序列测定

通过与GenBank中预测的多种鲤科鱼类TET1 mRNA序列比对,根据根据本实验室前期获得的团头鲂转录组中已有TET1序列,设计引物F1/R1(表1),以团头鲂脑组织cDNA第一链为模板进行PCR,分别扩增获得TET1基因片段序列。PCR产物经胶回收后连接至pGEM-T载体,筛选获得阳性克隆送上海生工测序,测序结果经整合确认其为目的条带。

表1 所用引物序列Tab.1 Primers sequences used in this study

1.4 序列及进化树分析

利用BioEdit 7.0.0.1、NCBI BLAST等软件对所得序列比对获得TET1基因序列。用NCBI BLAST对不同物种的TET1蛋白预测序列进行比较[17]。用Clustal X1.81同源比对蛋白序列,Phyre2、Pymol软件预测TET1蛋白的二级结构[18]。MEGA 6.06构建TET1系统发育进化树[19]。

1.5 整胚原位杂交(WISH)分析

根据原位杂交探针的设计原则,探针的引物(表1),用Primer5.0软件在ORF与3′UTR之间设计探针引物(700—1000 bp),进行常规TA克隆,送测,将质粒用内切酶进行单酶切,酶切产物作为模板进行体外转录,体外转录使用的地高辛作为标记[20]。

原位杂交实验[21]主要包括胚胎赋水、蛋白酶K处理、固定胚胎、去除固定、预杂交和杂交,然后探针的去除洗涤和抗体血清的封闭及抗体血清的去除、洗涤胚胎、罗氏BM染料显色和拍照等关键步骤。

1.6 荧光定量(qRT-PCR)分析

实时定量PCR使用PCR荧光定量仪(BioRad,Hercules,CA,USA),以18S[21]为内参基因,引物序列(表1),Mix使用SYBR Green Premix ExTaq(TaKaRa)。所得数据以Mean±SE的形式表示,用SPSS进行单因素方差法分析。

2 结果

2.1 团头鲂TET1基因的序列分析

团头鲂TET1基因全长为5526 bp,编码1841个氨基酸,通过Phyre2、Pymol软件模拟预测TET1蛋白二级结构,将团头鲂TET1与人类TET1、斑马鱼TET1对比,发现人类、斑马鱼与团头鲂TET1二级结构相似,都主要包括无规则卷曲及α螺旋(图1)。

通过MEGA 6.06软件构建系统发育树分析表明,TET1与对应的物种聚合度良好,团头鲂的TET1基因与无脊椎动物的TET1基因聚为一支,而人类、小鼠、虎鲸等脊椎动物聚为一支。在鱼类分支中,团头鲂的TET1与金线鲃、露斯塔野鲮和斑马鱼聚为一个小分支(图2)。

图1 人类、斑马鱼及团头鲂TET1二级结构预测Fig.1 The predicted secondary structure of TET1 in human,zebrafish and blunt snout bream

图2 团头鲂TET1基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of blunt snout bream TET1 sequences in vertebrates

2.2 TET1在胚胎和组织中的表达模式

整胚原位杂交结果显示,TET1基因在12 hpf时在头部检测到相对较弱信号(图3b),在24和36 hpf胚胎时期,TET1基因主要在头部强烈表达(图3d和3f);qRT-PCR检测结果显示,团头鲂TET1基因从受精卵开始就有表达,随着胚胎不断发育它们的表达水平明显的提高,在20 hpf处显著升高,并在20—44 hpf都维持在一个较高水平(图4a),这与原位杂交结果基本一致。如图4b所示,团头鲂TET1广泛表达于各个组织中,并在脑组织中高度表达,在肝、心和鳃组织中表达相对较低。

2.3 TET1在胚胎和组织中的低氧表达分析

通过qRT-PCR检测急性低氧胁迫处理团头鲂各组织中TET1的表达量,结果显示在低氧胁迫下,TET1基因在鳃、肝脏、心和脾组织中极显著地升高(P＜0.01),但在脑、皮肤、眼和肾脏中显著地降低(P＜0.01),氧含量恢复24h后,各个组织均有恢复的趋势,但大多尚未恢复到正常表达水平(图5)。胚胎低氧胁迫的检测结果显示,低氧处理组胚胎TET1基因相对表达量明显高于对照组(图6),尤其在24 hpf低氧处理组的表达量极显著地高于对照组(P＜0.001)。

3 讨论

团头鲂是一种不耐低氧的经济养殖鱼类。本研究中对团头鲂TET1的序列结构进行了分析研究,TET1序列比对及结构分析结果显示团头鲂TET1在3′ 端催化结构域高度保守,包括富含半胱氨酸区域(Cys-rich domain)和DSBH结构域,两者构成具有双加氧酶活性的结构。DSBH结构域包含3个保守的铁离子结合区和1个酮戊二酸结合区(2-oxoglutarate(2OG)-Fe(II)-dependent dioxygenases),参与将5mC羟化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)、5-羧甲基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)的主动去甲基化过程。另外,我们发现人类TET家族3′ 端都具有保守的催化结构域,这种结构可能决定了TET家族都具有催化5mC羟基化的酶活性。TET15′端有典型的CXXC zinc finger domain,CXXC结构域能增强对DNA CpG岛(富含胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的DNA区域)的定向结合能力,从而完成主动去甲基化的过程。二级结构预测结果显示,团头鲂与人类、斑马鱼的TET1结构相似,说明团头鲂TET1基因在长期进化过程中具有高度的保守性。进化树分析结果显示团头鲂TET1与其他硬骨鱼类具有良好的聚类关系,这些结果说明团头鲂TET1是硬骨鱼特异基因组复制产生。TET1基因保守的功能性结构域和氨基酸序列暗示着在进化过程中可能具有保守的生物学功能。

图3 团头鲂TET1基因各时期的原位杂交结果Fig.3 Whole-mount embryo in situ hybridization analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs

葛亮[22]在斑马鱼中的研究发现,斑马鱼TET1基因在22 hpf及36 hpf主要在头部表达。与在斑马鱼中研究相符,我们的研究结果显示,团头鲂TET1基因在早期表达相对微弱,中期和后期表达信号显著增强,都主要在头部表达。团头鲂TET1基因从受精卵开始就有表达,随着胚胎不断发育它们的表达水平有显著的提高但有一定的波动性,与原位杂交结果基本一致。这表明TET1可能参与胚胎发育过程,并在胚胎发育过程起着重要作用。有研究表明TET1在小鼠ES细胞的维持和囊胚期内细胞团特化相关[23,24]。团头鲂TET1基因在各个组织都有广泛的表达,并在脑组织中高度表达,这与在小鼠中的研究相吻合。Kriaucionis和Heintz[25]的研究发现,5hmC在小鼠脑组织高度分布。也有研究表明,TET1对小鼠脑部神经元的发育有重要相关性[26,27]。另外,我们发现除脑组织外,TET1基因在脾和肾等重要组织中也高度表达。

图4 团头鲂TET1基因在胚胎各时期(a)及成鱼各组织(b)的荧光定量表达分析Fig.4 qRT-PCR analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs levels during embryogenesis(a)and in adult tissues(b)

图5 TET1基因在各组织中的低氧转录响应Fig.5 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs in juvenile tissues*表示显著性(P＜0.01)

氧含量对生物体的生存与生长至关重要,氧含量易受天气等的影响而发生变化,生活在氧含量易变化的鱼类在进化过程中发展出适应低氧的复杂机制[28,29],在适应低氧应激的过程中,低氧应答相关基因的表达水平会发生变化[16,30]。在斑马鱼缺氧胁迫实验中,发现低氧条件下诱导了TET1的mRNA水平,引起5hmC水平增高[9]。本研究发现,团头鲂TET1基因在低氧胁迫环境处理的胚胎中显著的诱导表达,此结果表明,团头鲂胚胎期的TET1基因可以受到低氧胁迫的诱导。在幼鱼的急性低氧胁迫实验中,我们发现团头鲂TET1基因在鳃、肝和脾等组织中表达显著上调,在脑和皮等组织中表达显著下调,这可能暗示着TET1基因在低氧应答有重要作用。另外,我们发现随着溶氧的恢复鳃、脾和肝等组织中TET1的表达量并没有恢复到正常水平,说明24h恢复期不足以让团头鲂TET1基因在低氧胁迫中完全恢复。Jing等[9]的研究发现,与野生型相比,TET1敲除鱼对低氧更为敏感。根据在低氧胁迫下胚胎及组织中这些表达特征可以推断团头鲂TET1基因可能参与低氧胁迫响应,进而增强其对低氧的适应性。

4 结论

本文主要探究了团头鲂TET1的功能结构和胚胎各时期的时空表达模式,及在低氧应激条件下胚胎及幼鱼各组织中的差异表达分析。我们认为低氧胁迫下TET1基因的差异表达暗示这可能是一种潜在的低氧调控机制,需要我们进一步挖掘探究。本研究主要为TET1基因的功能探究提供参考依据,为参与低氧应答机制的研究提供了新的线索。

图6 TET1基因胚胎发育各时期的低氧转录响应Fig.6 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs during embryogenesis