荣爱梅，张 超，吴慧丽

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病与遗传和胰岛素抵抗相关[1]。NAFLD可逐渐发展为肝硬化。近年来，研究显示NAFLD可能是肝细胞癌的潜在诱因[2]。国内流行病学调查发现在特殊人群NAFLD发病率可达75%，已成为威胁公共健康安全的常见病[3]。西罗莫司属免疫抑制剂。有基础研究显示西罗莫司有助于改善肝脏脂质代谢[4]，但有关西罗莫司的临床应用尚存争议。调节性T细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)/辅助性T细胞17(T help cell 17，Th17)在稳定机体免疫功能和炎症反应过程中发挥重要作用，推测西罗莫司可能通过影响Treg/Th17比值进而影响NAFLD进展[5]。本研究应用西罗莫司干预NAFLD模型大鼠，分析了其对动物外周血Treg/Th17比值的影响，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 60只清洁级SD大鼠，体质量为150～200 g，平均为(175.4±24.2)g，由重庆医科大学动物实验中心提供。采用随机数字表法将60只大鼠分为对照组、模型组和西罗莫司干预组，每组20只。

1.2 NAFLD模型制备与处理 在西罗莫司干预组和模型组，给予高脂饮食喂养12 w，建立NAFLD动物模型。高质饮食由80%普通饲料与20%高脂饲料混合构成，其中80%普通饲料为小麦30%、玉米30%、鱼粉10%、骨粉3%、豆粕7%；20%高脂饲料为胆固醇3%、猪油7%、蛋黄粉10%。在对照组大鼠，给予普通饲料喂养14 w。在建模成功后，给予一组动物西罗莫司干预，即继续给予高脂饮食喂养2 w，同时给予西罗莫司(国药准字H20051140，福建科瑞药业有限公司)1 mg.kg-1.d-1灌胃，连续干预2 w；在模型组，在建模成功后继续给予高脂饮食喂养2 w。在实验结束时，给予水合氯醛腹腔注射麻醉，取血后处死大鼠，摘取肝脏，行组织病理学检查。

1.3 实验室检测 采用ELISA法检测血清白介素-10(interleukin-10，IL-10)、IL-17和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；使用全自动生化分析仪(械注进20112400234)检测肝功能和血脂血清生化指标；使用FACSVia型流式细胞仪(械注进20172402482)检测外周血Treg和Th17细胞百分比(福建三一造血技术有限公司)。

2 结果

2.1 三组肝组织病理学表现 见图1。

图1 三组肝组织病理学表现 (HE，200×) A：西罗莫司干预组，可见少量肝血窦充血，肝细胞体积增大，脂肪变减轻；B：模型组可见肝细胞脂肪变性，肝细胞体积大小不等，部分肝窦充血；C：对照组肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐

2.2 三组肝功能指标比较 干预后，西罗莫司干预组血清ALT和AST水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 三组肝功能指标比较

2.3 三组血脂指标比较 干预后，西罗莫司干预组血清TC和LDL-C水平显著低于模型组，而血清HDL-C水平显著高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.4 三组细胞因子水平比较 干预后，西罗莫司干预组血清IL-17和TNF-α水平显著低于模型组，而血清IL-10水平显著高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.5 三组外周血Treg/Th17细胞比较 干预后，西罗莫司干预组外周血Treg和Treg/Th17比值显著高于模型组，Th17细胞百分比显著低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，表4)。

表2 三组血脂指标比较

表3 三组细胞因子比较

表4 三组Treg/Th17细胞比较

3 讨论

NAFLD发病机制尚未完全阐明。目前认为，NAFLD的发生存在二次打击学说，二次打击不仅直接损坏肝组织，启动和加快病变进程，还增加了肝细胞坏死凋亡的易感性，临床多通过抑制炎症反应、改善肝纤维化及抗氧化应激控制NAFLD进展[6，7]，但对NAFLD治疗效果仍有限。如何改进NAFLD治疗效果成为临床和基础实验研究的重点。西罗莫司是首先由加拿大学者发现的免疫抑制剂，既往研究多用于器官移植和抗肿瘤治疗[8，9]。有人发现西罗莫司可显著改善肝脂肪变程度，可能为西罗莫司用于治疗NAFLD提供了依据[10]。

研究认为采取高脂饮食建立的NAFLD大鼠模型与人类NAFLD疾病极为相近[11]。本研究采用高脂饮食喂养12周的方法建立NAFLD大鼠模型，并给予西罗莫司平行对照干预，结果显示干预后西罗莫司干预组动物血TG、TC和LDL-C水平显著低于模型组，提示西罗莫司有助于改善NAFLD大鼠血脂水平。研究也发现西罗莫司能纠正胰岛素受体底物1磷酸化进程，并阻断胆固醇聚集，进而达到改善脂代谢水平的目的[12]。但临床也有报道认为西罗莫司可能通过抑制血脂降解过程诱发高脂血症[13]，但其具体机制尚不明确，有学者认为对于肝功能稳定期的患者，西罗莫司对血脂水平无显著的影响[14]。

炎症反应与NAFLD病理进展关系密切。既往报道认为炎症可直接阻断胰岛素信号通路，并诱发肝纤维化，损伤肝内皮细胞[15，16]。IL-10是机体抗纤维化和免疫调节重要的细胞因子，可通过抑制单核巨噬细胞的激活达到抑制炎症反应和降低肝内细胞浸润的作用[17，18]。IL-17是含有155个氨基酸的促炎因子，通过刺激成纤维细胞，加快T细胞活化作用，促进肝损伤[19，20]。有研究结果显示治疗后对照组血清IL-17和TNF-α水平显著低于西罗莫司干预组和模型组，血清IL-10水平显著高于西罗莫司干预组和模型组[21]，提示炎症反应参与了NAFLD的发生和发展。本研究进一步对比三组SD大鼠干预后血清IL-10、IL-17和TNF-α水平的变化，结果发现西罗莫司干预组血清IL-17和TNF-α水平显著低于模型组，而血清IL-10水平显著高于模型组，西罗莫司干预组与对照组之间无显著性差异，提示西罗莫司可通过抑制炎症反应，调节了外周血Treg/Th17细胞失衡状态，达到了改善NAFLD的作用。本研究也显示干预后西罗莫司干预组外周血Treg细胞百分比和Treg/Th17细胞比值均显著高于模型组，而Th17细胞显著低于模型组，提示西罗莫司可能通过调节辅助T细胞失衡状态，抑制NAFLD的病理学进展。

报道认为西罗莫司可通过抑制CD36蛋白表达，减少大鼠肝脏对游离脂肪酸的摄取，进而改善肝脏脂质聚集现象[22]。本研究结果发现实验结束时，西罗莫司干预组血清AST和ALT水平显著降低，提示该药能降低NAFLD大鼠血清酶水平，具有保护肝功能的作用[22]。有人认为维持4～8 ng/ml血药浓度的西罗莫司比较安全，有助于保护肝功能[23]，但临床也有学者发现应用西罗莫司可能增加发生肝功能异常的风险[24，25]，可能与应用的西罗莫司剂量和样本量差异有关，有关西罗莫司对肝功能的影响还有待今后进一步观察和研究。