孔祥忍，毛双双，刘欣宇，马胜男，孟令杰，陈家琦，李雅林

（山东第一医科大学，山东 泰安 271000）

百日咳是由百日咳鲍特杆菌（bordetella pertussis）感染引起的急性呼吸系统传染病，病程长且危害严重[1]。现行疫苗使用的铝佐剂及肌肉接种方法是影响疫苗效果的要素，开发更有效新型百日咳疫苗势在必行。佐剂因具有增强疫苗免疫应答的作用而广泛用作疫苗的重要成分。细菌样颗粒（bacterium-likeparticles，BLP）是近年来新被发现的新型佐剂，其成分是灭活的乳酸乳球菌，该细菌是一种常见的非致病细菌，被广泛应用在益生菌饮料和奶产品的生产，同其他常见的黏膜免疫佐剂相比，BLP 在安全性方面具有良好的优势[2-4]。近年来有报道BLP 用作佐剂可增强流感疫苗、肺炎链球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐剂尚不十分清楚。此外，接种途径也是影响疫苗效果的重要因素之一，百日咳是呼吸系统传染病，通过鼻黏膜途径进行疫苗接种是非常理想的选择，既能协调系统免疫反应和局部黏膜免疫，又能兼顾体液和细胞免疫。现行疫苗主要为肌肉接种，这也可能是导致现行百日咳疫苗免疫效果不理想的原因之一。为此，本研究拟制备BLP 作为百日咳疫苗的佐剂，探讨其用于百日咳疫苗后对小鼠的体液免疫作用及保护效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 健康8 周龄雌性NIH 小鼠50 只，鼠龄8 周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物均在山东第一医科大学实验动物中心SPF 级环境饲养。乳酸乳球菌购自上海丹曦化工科技有限公司，百日咳攻击菌和百日咳类毒素购自兰州生物制品研究所有限责任公司，氢氧化铝佐剂购自美国赛默飞世尔公司。百日咳毒素（pertussistoxin，PT）IgG ELISA 试剂盒和百日咳PT sIgA ELISA 试剂盒购自德国IBL 公司。本研究经山东第一医科大学动物伦理委员会审核通过。主要仪器：生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司，HFSafe1200LC）、分光光度计、旋转蒸发仪（上海巴玖实业有限公司，RE-6000A）、酶标仪（赛默飞世尔，Multiskan FC）、显微镜（日本奥林巴斯，CX43）、冷冻切片机（德国莱卡，Leica CM1850）。

1.2 方法

1.2.1 制备细菌样颗粒（BLP）佐剂 将乳酸菌菌种接种于含葡萄糖的M17 液体培养基中培养，经三氯乙酸处理并加热以裂解菌体，经离心、沉淀及洗涤可获得BLP。经染色及油镜观察BLP 形态。经旋转蒸发仪蒸发法测定BLP 干重。经分光光度计检测法检测BLP 浓度。通过各项参数的优化、制备形态大小合适、安全的细菌样颗粒用作佐剂。

1.2.2 制备百日咳类毒素疫苗 以0.3 mg BLP 为佐剂，以百日咳类毒素为抗原，将百日咳类毒素抗原以一定比例和用量混合，乳化混匀后保存于2 ℃～8 ℃中或直接用于免疫接种；以氢氧化铝为佐剂的疫苗，参照人用剂量进行换算，将类毒素抗原和铝佐剂吸附后再合并在一起，在2 ℃～8 ℃中保存或直接进行免疫。

1.2.3 实验分组及免疫方案 选取8 周龄雌性NIH小鼠，将50 只小鼠随机分为空白对照组、百日咳抗原+BLP 佐剂黏膜免疫组（BLP 佐剂黏膜组）、百日咳抗原+铝佐剂黏膜免疫组（铝佐剂黏膜组）、百日咳抗原+BLP 佐剂腹腔免疫组（BLP 佐剂腹腔组）和百日咳抗原+铝佐剂腹腔免疫组（铝佐剂腹腔组）。各组中BLP 剂量均为0.25 mg；黏膜组铝佐剂用量为0.1 mg，腹腔组剂量为0.5 mg；鼻黏膜组百日咳抗原剂量为5 μg，腹腔组百日咳抗原剂量为25 μg。黏膜免疫组进行常规滴鼻免疫，每只小鼠每个鼻孔滴加25 μl 疫苗，腹腔注射组进行腹腔注射0.5 ml 疫苗，空白组滴鼻并腹腔注射等量0.01 mol/L PBS（pH 为7.2～7.4），于第0 天和28 天免疫2 次。

1.2.4 疫苗安全性检测 接种后连续3 d 观察小鼠有无明显异常，如体质量减轻，重点观察鼻孔及口腔处是否有炎症、溃疡及脱毛现象，并抽检接种部位有无溃疡。

1.2.5 抗百日咳特异性抗体检测 在初次免疫后的第7、21 及35 天取血，分别采小鼠尾部静脉血100 μl左右，37 ℃静置1 h，然后4 ℃静置4 h，吸取上层血清备用。ELISA 检测抗百日咳毒素特异性IgG。免疫后第35 天，采集小鼠鼻洗液样本。将小鼠处死后固定于实验台上，剖开颈部皮肤，剪开小鼠气管，使用注射器将400 μl 灌洗液由气管注入，由鼻腔流出，收集灌洗液。对制备的鼻灌洗液行ELISA 检测抗百日咳毒素特异性sIgA。ELISA 操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 百日咳疫苗保护力检测 在初次免疫后42 d，于生物安全柜中进行菌液鼻腔攻击实验，攻击后第2 及14 天，取肺行HE 染色，进行肺损伤程度的病理评分。评分规则如下：损伤非常温和（+/-），温和（+），损伤中等（++），损伤严重（+++）。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疫苗安全性检测 接种后连续3 天，各组小鼠均未出现明显异常，无体重减轻，鼻孔及口腔处均无明显炎症、溃疡及脱毛现象，抽检的接种部位未见溃疡，疫苗具有良好的安全性。

2.2 各组小鼠血清抗百日咳毒素IgG 水平检测 各组小鼠接受百日咳疫苗免疫接种后，血清抗百日咳毒素IgG 抗体水平逐渐升高，对照组无抗体产生。接种7、21、35 天，BLP 黏膜组、铝佐剂黏膜组、BLP佐剂腹腔组和铝佐剂腹腔组抗百日咳毒素IgG 均高于空白对照组，且BLP 佐剂腹腔组和铝佐剂腹腔组均高于BLP 黏膜组和铝佐剂黏膜组，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中铝佐剂腹腔组抗体水平最高，见表1。

2.3 各组小鼠鼻洗液sIgA 水平比较 与空白对照组比较，各组sIgA 水平均升高，BLP 佐剂黏膜组sIgA水平最高，高于铝佐剂黏膜组、BLP 佐剂腹腔组及铝佐剂腹腔组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 百日咳杆菌鼻腔攻击后各组组织病理学损伤评估 攻击后14 天，取小鼠肺组织，经固定、HE 染色后进行显微镜观察，空白对照组小鼠肺组织表现为显著的病理组织损伤，而接受疫苗免疫各组小鼠肺内只出现轻微的炎性细胞浸润；与其他各组比较，BLP 佐剂黏膜组小鼠肺组织损伤较小，见表3。

表1 各组小鼠血清抗百日咳IgG 抗体水平比较（±s）

表1 各组小鼠血清抗百日咳IgG 抗体水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与铝佐剂黏膜组比较，bP＜0.05；与铝佐剂腹腔比较，cP＜0.05

表2 各组小鼠血清抗日咳sIgA 抗体水平比较（±s）

表2 各组小鼠血清抗日咳sIgA 抗体水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与铝佐剂黏膜组比较，bP＜0.05；与铝佐剂腹腔比较，cP＜0.05

表3 各组小鼠肺组织病理损伤评分结果

3 讨论

百日咳是由百日咳鲍特杆菌感染引起的急性呼吸系统传染病，接种疫苗是防治百日咳的最有效方法。目前所有市售的无细胞百日咳疫苗因其良好的安全性成为目前的主流疫苗，虽然在全球覆盖率达到85%以上，但该疫苗的保护力并不理想，近年来百日咳发病率不断攀升，因此开发更有效新型百日咳疫苗势在必行。

佐剂因具有增强疫苗免疫应答的作用而广泛用作疫苗的重要成分。研究显示，佐剂不同，疫苗的免疫效果差别很大。铝佐剂是应用最早、范围最广的佐剂，被用于制备白喉破伤风联合疫苗[5]。虽然铝佐剂仍然是目前应用最广泛的佐剂，但人们也逐渐开始发现它的局限性，如黏膜免疫效果不理想。BLP 是近年来新被发现的新型佐剂，其成分是灭活的乳酸乳球菌，乳酸乳球菌经热酸处理后球菌的细胞膜、细胞内的核酸、胞质等内容物被破坏，而构成细菌外壳的肽聚糖复合物被保留下来，而且也保留了细菌原有的形状和大小（直径大约1 μm），即成为BLP。BLP 不仅可作为疫苗佐剂使用，也可作为抗原成分的载体。BLP 模拟了微生物感染的天然途径进行抗原提呈，有细菌一样的大小与外形因此很容易被机体所吞噬，特别是在黏膜组织中。同其他常见的黏膜免疫佐剂相比，BLP 在安全性方面具有良好的优势[6，7]。近年研究报道BLP 用作佐剂可增强流感疫苗、肺炎链球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐剂尚不清楚[8-10]。

除了佐剂对疫苗免疫效果的影响之外，接种途径亦对疫苗的免疫效果有较大影响。百日咳是呼吸系统传染病，通过鼻黏膜途径进行疫苗接种是非常理想的选择，这样既能协调系统免疫反应又能激发局部黏膜免疫。然而，目前应用的百日咳疫苗均采用肌肉注射，此类疫苗能够促使机体产生足够的体液免疫应答，但并不能充分诱导以sIgA 分泌为标志的局部黏膜免疫，现有疫苗在这方便的缺陷很可能是导致百日咳死灰复燃的另一重要原因。通过鼻腔进行百日咳疫苗免疫接种是激活和强化局部黏膜免疫防御的有效方法，与肌肉注射和皮下注射相比，鼻腔免疫与百日咳的自然感染更加相似，预计能够有效的诱导系统免疫应答和局部免疫应答。

本研究比较了百日咳疫苗通过鼻黏膜和腹腔两种途径免疫的差异，在两种途径中分别比较了BLP 和氢氧化铝佐剂作用的效果。结果显示，尽管以BLP 为黏膜佐剂的百日咳疫苗在诱导系统性IgG 水平方面略低于传统铝佐剂疫苗，但其经鼻黏膜免疫效果优于传统铝佐剂疫苗，可获得较好的免疫效果，能够提高小鼠鼻黏膜sIgA 抗体水平，提高小鼠抵御活菌攻击的能力，降低小鼠肺组织病理损伤。本研究也存在一定的不足，由于实验条件限制，未研究疫苗对细胞免疫的诱导作用，在以后的工作中，将深入研究以BLP 为佐剂的百日咳抗原疫苗对细胞免疫的诱导作用。

总之，新型佐剂-细菌样颗粒通过黏膜免疫保护作用最佳，其主要通过诱导产生高滴度的sIgA 发挥作用。