李敏杰，熊亚

1. 攀枝花学院生物与化学工程学院（攀枝花 617000）；2. 攀枝花市干热河谷特色生物资源工程技术中心（攀枝花 617000）

蜂蜜酒是以蜂蜜为原料，经过稀释、调整、发酵、澄清、过滤、陈酿后所获得的低度酒精饮料[1]。蜂蜜的主要成分是葡萄糖、果糖及其他高级营养成分，因此以蜂蜜为原料酿造的蜜酒对人体具有很强的保健作用[2]。蜂蜜酒中含有多种维生素、矿物质和人体必需的18种氨基酸等，对治疗失眠、健忘、精神不振、性功能衰退等有良好的辅助作用，对胃肠慢性病、慢性支气管炎、哮喘等痼疾有良好作用[3]。此次试验选取产自攀枝花老盐边大山深处的土蜂蜜，相比传统农家蜂蜜以及意蜂蜜而言，土蜂蜜在美容、减肥、养生方面效果更好。

近年来，以蜂蜜为原料生产的蜂蜜酒，其保健功能集蜂产品和发酵产品为一身，以保健酒为基础的蜂蜜酒开发更具特色[4]，对蜂蜜酒的酿制已经不仅仅局限于纯蜂蜜酿酒，更多的蜂蜜保健酒开始出现在市场、民间作坊中，如绿茶蜂蜜酒[5]、红曲蜂蜜酒[6]、发酵型五味子蜂蜜果酒[7]、红枣蜂蜜保健酒[8]等。对各种类型蜂蜜酒的研制更加注重发酵工艺的优化，章芒芒等[9]采用正交设计的统计学方法，对蜂蜜酒主发酵的最佳条件进行了研究，得出温度、尿素添加量、磷酸铵比例、pH及酵母接种量、发酵周期的最佳值；王淼[10]则从发酵温度、总酸度、溶解氧及菌数控制等方面对蜂蜜酒发酵参数进行了最优化组合；陶树兴等[11]通过蜂蜜酒发酵及杂醇油含量的变化，探讨了氮源种类和浓度对它们的影响，为蜂蜜酒的酿造提供了一定的参考。目前，利用响应面法对蜂蜜酒发酵条件优化的研究报道还很少。此次试验以攀枝花土蜂蜜为原料，以土蜂蜜酒发酵产酒精度为响应值，采用单因素试验和响应面分析法对土蜂蜜酒发酵条件进行优化，以期为攀枝花土蜂蜜的开发应用提供一定的参考价值。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

攀枝花土蜂蜜（攀枝花市售）；酵母（安琪高活性酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司）；亚硫酸（99.8%，成都科龙化工试剂厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

土蜂蜜→稀释→灭菌锅杀菌30 min→冷却到25～30 ℃→加酵母（活化35 min）→主发酵→澄清→陈酿后发酵→过滤→调配

称取300 g的土蜂蜜，加1 L的蒸馏水稀释，于110 ℃灭菌30 min。冷却后装入发酵罐，加入活化后的酵母，调节pH，放入恒温箱进行发酵。发酵结束后，倒罐、过滤[12]，低温下进行陈酿，检测酒精度。

1.2.2 单因素试验

选用pH、温度、酵母菌添加量及通气量4个因素，按照不同的pH（3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、温度（15，20，25，30和35 ℃）、酵母菌添加量（1%，2%，3%，4%，5%和6%）、通气量（0，1，2，3和4次/d）进行单因素试验，检测土蜂蜜酒发酵的酒精度。

1.2.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，利用SAS 9.2软件中Box- Behnken设计原理，进行四因素三水平的响应面分析和数据处理，以pH（X1）、温度（X2）、酵母菌添加量（X3）及通气量（X4）为自变量，以酒精度（Y）为响应值，确定各因素对响应值的影响，得到土蜂蜜酒发酵的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH对土蜂蜜酒酒精度的影响

由图1可知，当pH为4.5时，土蜂蜜酒的酒精度达到最高，为9.6%vol。酵母菌的生长对pH比较敏感，pH过低或pH过高均会抑制其生长，从而影响酒精的生成。

图1 pH对土蜂蜜酒酒精度的影响

2.1.2 发酵温度对土蜂蜜酒酒精度的影响

由图2可知，当温度升高时，酒精度也上升，这是由于酵母菌的生长发育及代谢活动受温度影响比较大。酵母菌的一切生理活动与酶的活力相关，而酶活力要在最佳温度范围内才得以发挥。当温度超过25 ℃时，酵母菌离开了最适温度范围，生长代谢变慢，所以酒精度也开始下降。因此选择发酵温度25 ℃。

2.1.3 酵母添加量对土蜂蜜酒酒精度的影响

由图3可知，增加酵母添加量可以使生成的酒精度增加，这是由于足够的酵母菌添加比例，可以快速地使酵母菌在发酵醪液中占据优势地位，抑制杂菌的生长，从而使酒精生成量增加。而当酵母菌浓度超过4%时，由于发酵醪液中的营养物质有限，酵母菌的生长在后期会放缓，造成早衰，使酒精生成量下降。所以酵母菌接种量在4%时最适宜。

图2 发酵温度对土蜂蜜酒酒精度的影响

图3 酵母菌添加量对土蜂蜜酒酒精度的影响

2.1.4 通气量对土蜂蜜酒酒精度的影响

酵母菌的生长繁殖需要氧参与，所以提供必要的通气量对酒精度的生成有益。但是由于酒精生成是厌氧过程，过多的通氧会导致葡萄糖完全氧化为二氧化碳、水和能量，减少酒精的生成。由图4中可知，当通气量为1次/d时，酒精生成量达到最大。

图4 通气量对土蜂蜜酒酒精度的影响

2.2 响应面分析

2.2.1 选取响应面分析的因素及水平

根据单因素试验结果，进行四因素三水平的响应面试验分析，其因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2.2.2 响应面试验方案及结果

对pH（A）、发酵温度（B）、酵母添加量（C）及通气量（D）作如下变换：X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1。以X1、X2、X3、X4为自变量，酒精度为响应值（Y），方案及结果见表2。

表2 响应面试验方案及试验结果

从表3可知，模型的p=0.000 1＜0.01，表明模型方程极显著。失拟项p值=0.065 4＞0.05，说明方程对试验的拟合度良好，此方法可靠。X2、X3、X4对Y有显著性影响，X2、X4为正效应，X3为负效应，X2影响极显著；二次项X22、X32对Y也有显著影响，均为负效应，X32影响极显著。其余变量的影响均不显著（p＞0.05）。结合表3各项数值可以分析出，各因素对土蜂蜜酒酒精度的影响程度依次为温度、酵母菌添加量、通气量、pH。

2.2.3 土蜂蜜酒发酵条件优化的响应面及等高线图

响应面图形是响应值Y酒精度对各试验因子X1、X2、X3、X4的函数图形，可以选择出试验设计中的最优化条件，从响应面图形上可以得出最佳参数及各参数之间的相互作用[13]，响应面分析等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响[14]。土蜂蜜酒发酵条件响应面分析及等高线图见图5～图10。

分别对二次回归方程的X1、X2、X3、X4求一阶偏导，求解，得：X1=-0.279 6，X2=1.367 1，X3=-0.203 3，X4=0.621 8。代入变换公式X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1。可得pH为4.36，发酵温度为31.8 ℃，酵母菌添加量为3.59%，通气量最多为2次/d。在此条件下，蜂蜜酒发酵酒精度的理论值为11.6%vol。

表3 回归分析结果

图5 Y=f (X1, X2)的响应面及等高线图

图6 Y=f (X1, X3)的响应面及等高线图

图7 Y=f (X1, X4)的响应面及等高线图

图8 Y=f (X2, X3)的响应面及等高线图

图9 Y=f (X2, X4)的响应面及等高线图

图10 Y=f (X3, X4）的响应面及等高线图

2.2.4 验证试验

为验证响应面法所得结果的可靠性，在上述最佳发酵条件下重复土蜂蜜酒发酵3次，测得的平均酒精度为11.1%vol，与模型预测值11.6%相接近，可见模型能较好地预测实际土蜂蜜酒发酵酒精度的情况，所以基于响应面优化的土蜂蜜酒发酵条件参数比较可靠。

3 结论

采用响应面优化土蜂蜜酒发酵条件得到的酒精度的回归方法，通过方差分析，证明方程对试验的拟合度良好。对土蜂蜜酒酒精度影响因素的排名依次为温度、酵母菌添加量、通气量、pH。土蜂蜜酒发酵最佳参数为pH 4.36、发酵温度31.8 ℃、酵母菌添加量3.59%、通气量2次/d。在此条件下，土蜂蜜酒发酵产酒精度的理论值为11.6%vol，与验证试验11.1%vol比较接近。此款土蜂蜜酒颜色金黄，有蜂蜜的清香，酒香浓郁，口味独特，为攀枝花土蜂蜜的开发应用提供一定的参考价值。