王晓楠，徐 晖，张文博

1.大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116011；2.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，哈尔滨 150081；3.南岗区疾病预防控制中心，哈尔滨 150000

碳青霉烯类药物被认为是治疗多重耐药革兰氏阴性杆菌感染的最后手段。随着碳青霉烯类药物在临床上的应用越来越多，碳青霉烯类抗菌药物耐药现象也日益增加。自2010年以来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Crabapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的流行情况恶化，CRKP继续在欧洲医院蔓延，特别是在地中海地区。2012年中国的检出率显著高于美国［1］。肺炎克雷伯菌主要引起肺炎，肺外感染也并非少见，如尿路感染，胆道感染，菌败血症等，其中菌败血症病情凶险，病死率高达37%～50%，故本实验选择研究大连地区血流感染（Bloodstream Infection，BSI）耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药特征，为临床抗生素的选择提供依据，降低CRKP-BSI相关的发病率和死亡率。同时在流行病学分析上也是有意义的。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2017年1月—2018年12月在大连医科大学附属第一医院住院患者的血流感染肺炎克雷伯菌206株。这些患者的病历特点是临床上骤发寒战，有高热表现，进行血培养检测，血培养检测结果显示肺炎克雷伯菌感染呈阳性。纳入标准：血液培养分离的致病菌为肺炎克雷伯菌，半年内同一患者有多次（2次及以上）肺炎克雷伯菌的血流感染，取首次感染菌株；并且达到血流感染诊断标准，参照2016年美国CDC［2］；年龄大于等于18周岁患者。将感染碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌作为实验研究组（CRKP组），共55例；感染对碳青霉烯类药物敏感的肺炎克雷伯菌（Carbapenem susceptible Klebsiella pneumoniae，CSKP）作为实验对照组（CSKP组），共151例。查阅病历资料包括患者性别、年龄等基础信息，所患主要疾病以及住院过程中全部诊疗记录，同时进行上述一般资料各参数间的统计分析，证实差异无统计学意义。

鉴于大连医科大学附属第一医院是大连市规模最大的综合性医院，患者主要来自大连市不同县区，206例患者中，1例来自长海县，9例来自庄河，28例来自普兰店，17例来自瓦房店，151例来自大连市内四区。因此，实验结果可以代表大连地区的流行情况。

1.2 质控菌株

大肠埃希菌 ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，铜绿假单胞菌ATCC27853，以上菌株均由卫生部临检中心提供。

1.3 实验仪器及试剂

HF safe-1200型生物安全柜（力康发展有限公司，中国）、BACTEC FX-200/9240型全自动血培养仪（美国Becton Dickinson公司）、CO2培养箱（美国Thermo公司）、Microscan Walk-Away 96plus全自动细菌鉴定及药敏分析仪及配套试剂（德国Siemens公司）、舒普森（头孢哌酮/舒巴坦）药敏纸片（英国Oxoid公司）等。

1.4 细菌培养鉴定及药敏实验方法

菌株鉴定及药敏实验采用MicroScan Walkaway 96 plus全自动微生物鉴定及药敏系统完成，参照临床实验室标准委员会（CLSI 2017版）的标准判读结果。头孢哌酮/舒巴坦采用K-B纸片扩散法测定，方法如下：（1）制备菌悬液：将培养后的纯菌落用无菌棉签蘸取适量，溶解于2 ml无菌生理盐水中，混匀后用比浊仪校准浓度至0.5麦氏浊度。（2）无菌棉签蘸取适量上述0.5麦氏浓度的菌悬液，于MH琼脂培养基表面均匀涂布接种，每次接种涂布时，将平板旋转60°，连续涂布接种3次，最后沿着平板边缘再涂抹2周。（3）贴药敏纸片：将接种好的MH培养基在室温下放置3～5 min，按照实验室标准操作规程，用无菌镊子取药敏纸片，将其贴于琼脂表面。操作时注意纸片不能过于贴近平板边缘，其中心需距离平板边缘大于等于15 mm。（4）孵育：将接种好的培养基于15 min内放置恒温培养箱孵育，孵育时间16～24 h。（5）结果判读：用游标卡尺（精确度为1 mm）测量抑菌环直径，以肉眼不能明显见到菌落生长区域为抑菌环边缘，根据测得的抑菌环直径大小来判断该菌株对相应抗生素的敏感性，结果根据美国实验室标准化协会CLSI2017版所提供的肺炎克雷伯菌的抑菌环直径解释判读。

1.5 统计学方法

将收集的数据运用Excel表格进行整理，计算构成百分比。然后采用SPSS 17.0统计软件对其进行统计，计算χ2值及P值，进行差异性分析，当P＜0.05时提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 碳青霉烯类抗生素耐药与敏感菌株耐药性

图1、表1显示血流感染CRKP的分离率为26.70%（55/206），CSKP分离率为73.30%（151/206）。碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对以下21种抗生素的耐药率均大于敏感株，有显著性差异（P＜0.05）。相比之下，CRKP对氨基糖苷类抗生素阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素耐药率较低，分别为52.73%、67.27%、70.91%。

图1 CRKP和CSKP对常用抗菌药物的耐药率柱状图示

表1 2017-2018年血液分离CRKP和CSKP对常用抗菌药物的耐药性 例%

2.2 耐药性分析

从图2可以看出除头孢曲松外，血流感染肺炎克雷伯菌对其它20种抗生素耐药率2018年比2017年均有所降低。

图2 2017、2018年血液分离肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率（%）柱状图示

表2、图2中的206株肺炎克雷伯菌药敏分析结果显示：2017年、2018年该菌对哌拉西林的耐药率最高，2017年为66.98%、2018年为61%；对氨基糖苷类阿米卡星的耐药率表现为最低，2017年为18.87%、2018年为13.00%；在对β-内酰胺酶抑制剂的敏感性方面，该菌对头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要优于氨苄西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。2017年头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为32.08%，哌拉西林/他唑巴坦的耐药率为34.90%，氨苄西林/舒巴坦的耐药率为42.45%，替卡西林/棒酸的耐药率为44.34%，2018年头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率均为29.00%，氨苄西林/舒巴坦的耐药率为40.00%，替卡西林/棒酸的耐药率为39.00%。对比2017年和2018年，该菌对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁和妥布霉素、庆大霉素的耐药率有显著性差异，此五种抗生素的耐药率2018年较2017年有所降低，对其余16种抗生素的耐药率均无显著性差异。

2.3 血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药与敏感的生存分析

206株血流感染肺炎克雷伯菌28天的总死亡率为20.39%（42例），碳青霉烯类耐药组的死亡率为50.90%（28例），而碳青霉烯类抗生素敏感组的死亡率为9.27%（14例），统计分析结果显示血流感染肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药组患者28天死亡率明显高于碳青霉烯类抗生素敏感组患者，P＜0.05，有显著性差异，见图3。

图3 感染CRKP和CSKP患者的生存曲线分析

3 讨论

鉴于肺炎克雷伯菌对氨苄西林天然耐药，以及替加环素的使用说明，替加环素主要是用于呼吸系统的感染，不适于血流感染，故本研究未做氨苄西林和替加环素的药敏实验。研究结果显示，肺炎克雷伯菌对头孢西丁的耐药率较其他头孢菌素类抗生素耐药率低，2017年为36.79%，2018年为28%。对碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素阿米卡星保持较低的耐药率。这与文献报道的国内其他地区检测的肺炎克雷伯菌的耐药性结果基本一致［3-7］。在对β-内酰胺酶抑制剂的敏感性方面，该菌对头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的敏感度要优于氨苄西林/舒巴坦和替卡西林/棒酸。从图2柱状图可以直观看出该菌株对上述20种抗生素的耐药率2018年较2017年均有所降低，分析原因，医院的检验科对患者的耐药情况进行连续监测，并及时与院感科和临床进行反馈沟通。院感科严格进行院内感染的监测，控制感染，同时加强对临床医生抗生素合理使用的培训。临床医生在治疗过程中对抗生素使用更加慎重，摒弃了以往滥用的行为，取而代之的是积极治疗患者原发疾病，尽可能减少侵袭性操作，在必要的侵袭性操作过程中，尽量降低感染风险。患者在医生的宣教下，通过饮食、锻炼、合理规律的作息来不断提高自身免疫力，同时积极配合医生的治疗，陪护人员也能注意手卫生。本研究仅选择了近两年符合条件的样本，后期将继续跟踪，加大样本量进行耐药特征相关性试验，探索耐药率降低的具体原因，但是实验结果可以说明本地区血流感染肺炎克雷伯菌的耐药情况得到了有效的控制。

表2 2017-2018年血液分离肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性分析 例%

本实验从大连地区206例血流感染肺炎克雷伯菌中分离出耐碳青霉烯类抗生素菌株共55株，百分率为26.70%（55/206），这与国内研究结果基本一致［8］。研究结果表明，CRKP对氨基糖苷类抗生素阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素耐药率相对较低，分别为52.73%、67.27%、70.91%，临床上对于CRKP建议采取联合用药，增强药物间潜在的协同作用，减缓耐药性，降低不良反应。

CRKP对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制复杂，包括产碳青霉烯酶、高产AmpC酶或ESBLs、外膜蛋白的缺失、高表达的主动外排泵系统，其中产生碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要耐药机制，故以后的研究将补充耐药基因实验。本实验仅选取了2017年和2018年两年的研究数据，日后会持续研究，扩大样本量，全面了解本地区耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药趋势与特征，完善实验结果。