张照然,何朋杰,李兴玉,何鹏飞,吴毅歆,范黎明,何月秋**

(1.辽宁省抚顺市农业科学研究院,辽宁 抚顺 113300;2.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201;3.云南农业大学 基础与信息工程学院,云南 昆明 650201;4.云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650201;5.微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心,云南 昆明 650217)

硫代葡萄糖苷是植物体内合成的一类含氮次级化合物,以十字花科植物体内的硫代葡萄糖苷含量最高[1]。所有硫代葡萄糖苷都由一个含糖基团、硫酸盐基团和可变的非糖侧链(R)组成。基于R基团的不同,硫代葡萄糖苷可以分为3类:脂肪族硫代葡萄糖苷、芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚族硫代葡萄糖苷[2]。硫代葡萄糖苷经植物黑芥子酶水解后可以产生一系列具有生物活性的水解产物,如异硫氰酸酯(ITCs)、硫氰酸酯(TCs)和腈类(nitriles)等化合物[17]。异硫氰酸酯具有较高的生物活性,如对大肠埃希菌属、沙门菌属、金黄色葡萄球菌等都具有很强的杀菌力[3]。

十字花科根肿病是世界范围内的毁灭性土传植物病害,受到根肿菌侵染后的植株主根或侧根薄壁组织膨大或形成肿瘤。根肿病菌在土壤中可存活10年以上,田间土壤一旦受到根肿病菌的污染,就不再适宜栽培十字花科蔬菜[4-5]。在已知的研究中,植物体内的硫代葡萄糖苷的含量和种类与根肿病的发生有着密切的联系[6]。目前针对十字花科根肿病主要的防治方法为农业防治、化学防治和生物防治。其中农业防治和化学防治都有明显的弊端,而生物防治作为一种新型的防治手段正在逐步兴起。云南农业大学何月秋团队从白菜根肿病病田中分离得到1株枯草芽孢杆菌BacillussubtilisXF-1,其对十字花科根肿病具有良好的防治效果[7]。本实验室的研究人员在前期试验中已从十字花科植物的根部分离出一种异硫氰酸酯类化合物,经GC-MS和HPLC鉴定为异硫氰酸苯乙酯。本试验从生防菌与十字花科作物的互作入手,研究了十字花科作物体内异硫氰酸苯乙酯含量的变化,以期进一步明确生防菌的防病机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)XF-1(后文简称为XF-1),由云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心分离并保存。

供试十字花科作物:大白菜(Brassicarapa)，品种为鲁春白1号；油菜(Brassicanapus)，品种为金油1306；大头菜(Brassicajuncea)，品种为特选；红菜苔(Brassicacampestris)，品种为红衣少女；花椰菜(Brassicaoleracea)，品种为昆明90天；萝卜(Raphanussativus)，品种为松太萝卜；水果萝卜(Raphanussativus)，品种为日本水果萝卜。各作物的种子均购于昆明龙头街农贸市场。各种子在恒温光照培养箱内催芽后,选取长势一致的6株幼苗，种植于同一规格(16 cm×12 cm)的营养钵内；每个品种各选取10盆幼苗,种植于温室大棚内。在试验期间,每天早晚各浇水1次,并旋转1次花盆(防止边际效应);在试验期间不喷洒任何农药。

1.2 试验方法

1.2.1 XF-1菌株发酵液的制备 在LB固体培养基上活化供试的XF-1,在37 ℃下培养72 h后用接种环挑入盛有40 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶内,置于180 r/min恒温摇床中37 ℃培养24 h,作为种子液；吸取5 mL种子液到盛有250 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶内,采用相同条件扩大培养72 h。在制备完成后稀释调制成1×107cfu/mL的接种液,置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 生防菌株XF-1的接种 于播种后第7天,分别将XF-1接种液和相同稀释倍数的LB液体培养基浇灌至营养钵中,每钵50 mL,共处理4次,每7 d接种1次。

1.2.3 植株根系内ITCs的提取 HPLC分析仪器与药品：安捷伦公司的Agilent 1260工作平台,分析柱为SB-C18 Analytical HPLC Column 4.6 mm×250 mm；异硫氰酸苯乙酯标准品，购于Sigma-Aldrich公司,纯度为色谱纯；流动相中的水为超纯水,乙腈为色谱纯。

标准品溶液的配制:精确称取异硫氰酸苯乙酯标准品10 mg,用乙腈溶解,并定容至50 mL，稀释后浓度为0.2 μg/μL；将其转移至棕色样品瓶中备用。

样品的采集与处理:取第一次接种XF-1后培养30 d的十字花科作物根部组织各10 g,在研钵研磨后转至容量瓶中,用甲醇定容至50 mL,静置2 h后,过0.22 μm的有机滤头,将滤液装入1.5 mL的色谱样品瓶中,用于HPLC的检测。

样品中ITCs含量的HPLC分析：参照Lim等[16]的方法,略有改动。紫外检测器使用的波长为246 nm,柱温30 ℃,进样量为10L。流动相A为色谱纯乙腈,流动相B为超纯水；在20 min内流动相A由20%的乙腈升至100%的乙腈,流速为1 mL/min。

1.2.4 十字花科作物根系内黑芥子酶活力的测定 参照Li等[15]的方法。取第一次接种XF-1后培养30 d的各十字花科作物根部组织1.5 g,剪碎后加入10 mL的提取缓冲溶液,冰浴研磨,涡旋振荡后以12000 r/min离心30 min,回收上清,作为酶提取液备用(酶液可置于-80 ℃冰箱内短期保存)。

将2.05 mL反应体系溶液置于1 cm光路石英比色杯中,在37 ℃条件下混合平衡1 min,向反应体系溶液中添加20L酶提取液，然后静置7 min,于37 ℃反应10 min,测定227 nm波长处的吸光度,计算酶活力,所有样品重复3次。在一定条件下,单位材料(鲜重)每分钟降解1mol底物黑芥子硫苷酸钾的酶量为一个酶活力单位(U/mg),其计算公式如下:U=(N×VEX)/(VE×t×mF)。式中N为反应时间内黑芥子酶降解黑芥子硫苷酸钾的量(μmol);t为反应时间(min);VE为酶液体积(mL);VEX为提取液体积(mL);mF为材料鲜重(mg)。

2 结果与分析

2.1 浇灌XF-1对植株根系内异硫氰酸苯乙酯含量的影响

2.1.1 异硫氰酸苯乙酯的线性分析 取适量标准品溶液,分别按0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg依次进样,在1.2.3的色谱条件下测定异硫氰酸苯乙酯的峰面积。以样品的进样量(X)为横坐标,以峰面积(Y)为纵坐标,得到回归方程Y=353202.28X+2.4209217,r=0.9999。结果表明,当异硫氰酸苯乙酯的进样量在0.4～2.0 μg范围内时,峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.1.2 异硫氰酸苯乙酯的HPLC检测结果 HPLC检测结果(表1)表明：在供试的7种十字花科蔬菜中，对照组的异硫氰酸苯乙酯含量以萝卜属中的白萝卜和水果萝卜居前两位,分别为2.369和0.674 mg/g；生防菌XF-1处理组的异硫氰酸苯乙酯含量均比对照组有所提高,以大头菜的异硫氰酸苯乙酯含量增长最明显，增长率达122.09%，而增长率最低的是大白菜,仅为3.97%。

表1 经XF-1处理后十字花科作物根系内异硫氰酸苯乙酯含量的变化

2.2 浇灌XF-1对植株根系内黑芥子酶活性的影响

2.2.1 黑芥子硫苷酸钾的标准曲线 分别取25.18 mmol/L的黑芥子硫苷酸钾标准品0、12.5、25.0、37.5、50.0、70.0 μL,用缓冲液将其定容至2.07 mL,测定其在227 nm波长处的吸光度。以浓度x(mmol/L)为横坐标,以吸光度y为纵坐标绘制标准曲线。计算得到黑芥子硫苷酸钾标准曲线的回归方程:y=6.7114x+0.0378,r=0.9972,表明浓度与吸光度呈极显著的正相关。

2.2.2 黑芥子酶活性的变化 经生防菌株XF-1处理后,各十字花科作物根系内黑芥子酶的活性均较对照有不同程度的提高,其中大白菜提高了51.09%,油菜提高了61.69%,红菜苔提高了26.53%,大头菜提高了12.31%,萝卜提高了68.33%,水果萝卜提高了5.27%,花椰菜提高了44.81%(图1)。

3 讨论

芸薹根肿菌可以引起十字花科植物和某些非十字花科植物根肿病的发生,但发病的严重程度与植物体内的硫代葡萄糖苷的含量和种类有着密切的联系,在某些含有硫代葡萄糖苷的非十字花科作物上,芸薹根肿菌可以引起该植物根部肿大[6]。在十字花科植物中,接种芸薹根肿菌后,未发病或发病程度较轻的植物体内主要含有芳香族硫代葡萄糖苷,不含或很少含有吲哚族硫代葡萄糖苷;在发病较重的植物体内含有脂肪族和吲哚族硫代葡萄糖苷,其中吲哚族硫代葡萄糖苷含量较高[6,8]。在不同的十字花科植物体内,吲哚族硫代葡萄糖苷都被发现是生长素合成的前体物质,同时其含量在根部肿瘤的形成过程中也有一定的变化[9]。

在十字花科植物中,体内的硫代葡萄糖苷-黑芥子酶是一种重要的植物保卫系统[18-19],当植物受到外部机械力的作用或病原菌侵染时,该系统会发挥作用,降解硫代葡萄糖苷产生异硫氰酸酯(ITCs)、硫氰酸酯(TCs)和腈类(nitriles)等化合物,其中硫氰酸酯类化合物具有较高的抗菌活性,可以抵御病原菌的侵袭。同时,该系统是十字花科植物抵御菌核病和根肿病的保卫系统[20-21]。本试验测定了生防菌XF-1处理几种十字花科植物前后植株体内的异硫氰酸苯乙酯含量,发现对照组的萝卜和水果萝卜具有较高的异硫氰酸苯乙酯含量。据有关报道，萝卜属植物的根肿病发病率较低,并且具有较高的抗性[10-11],这与本试验检测到的萝卜属内异硫氰酸酯的含量较高的结果基本一致。当植物感染根肿菌后,其体内的黑芥子酶被诱导表达,去水解相应的硫代葡萄糖苷,产生具有一定抗菌生物活性的异硫氰酸酯类化合物[9]。在本试验中,经生防菌XF-1处理后,十字花科植物体内的黑芥子酶的活性均有不同程度的提高,同时检测到十字花科植物体内异硫氰酸苯乙酯的含量也相应提高。但在十字花科植物体内异硫氰酸苯乙酯含量的提高幅度与黑芥子酶活性的提高幅度并没有表现出良好的相关性,这可能与本试验只检测了硫代葡萄糖苷的单一酶解产物(异硫氰酸酯类)有关。酶解产物异硫氰酸酯含量的升高,也可能是生防菌XF-1直接降解的结果。此前曾有报道称硫代葡萄糖苷可以被某些微生物直接降解,产生一系列的活性化合物[17]。也有可能XF-1提高了黑芥子酶的活性,从而促进了硫代葡萄糖苷的水解,产生大量的抗菌活性物质来抵御根肿菌的侵入。据Rengasamy等[19]报道，将一种褐藻提取物喷施于十字花科植物可以引起植物黑芥子酶活性的提高,以抵抗蚜虫的侵害。这与本试验用生防菌XF-1防治十字花科植物根肿病的过程相似。由于生防菌XF-1的体积比根肿菌小[12-13],且XF-1是1株十字花科植物的内生菌,因此更容易进入植物体内,从而诱导植物的抗性,减轻根肿病的发生程度。

图1 经XF-1处理后十字花科作物根系内黑芥子酶活性的变化