王 玉，李 希，冯建安，黄 嫣，毛 红，赵 强，施崇精

(四川省中医药科学院 中医研究所，四川 成都 610031)

痔疮是我国城市居民常见肛肠科疾病之一，近年来随着饮食结构和生活方式的改变，其发病率逐渐上升[1]，发病人群分布广泛，任意年龄段均可发病，痔疮的临床症状有肛周疼痛、肛门肿胀、大便滴血、便干或秘结等[2]，对患者的生活与工作影响极大。冰硼痔疮栓功能消炎止痛、生肌止血，能够有效缓解各期痔疮疼痛和出血，调节微循环，促进毛细血管新生，促进创面修复，临床疗效显著，且不良反应少[1]。

冰硼痔疮栓由黄连、黄柏、大黄、地榆、苦参、紫草、冰片、硼砂等15味药材组成，根据原处方工艺及药材性质，其中5味药材采用乙醇提取工艺，分别是黄连、黄柏、大黄、地榆、苦参，黄连和黄柏均具有清热燥湿、泻火解毒的功效。现代药理研究表明[3-8]，盐酸小檗碱是黄连和黄柏抗炎的主要成分，因此，本研究以盐酸小檗碱含量为主要指标并结合出膏率评价冰硼痔疮栓的提取工艺。评价提取工艺的关键是工艺设计和对各指标的赋权，本研究采用信息熵赋权与响应面设计结合[9-10]，优选冰硼痔疮栓提取工艺参数，从而获得质量稳定均一的浸膏，为制剂的后期研究及工业化生产提供了实验依据，现将实验过程报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(Waters公司)；Waters 2998 PDA检测器(Waters公司)；BT-125D分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；BH-15电子天平(启东友铭衡器有限公司)；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试药

黄连饮片、黄柏饮片、大黄饮片、地榆饮片、苦参饮片均购于四川省中药饮片有限责任公司，由四川省中医药科学院中医研究所谢守德主任中药师鉴定为真品，均符合2015年版《中国药典》有关规定；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201814，含量86.7%)，购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 指标成分的定量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)；乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)；检测波长254 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 取盐酸小檗碱对照品精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为1.12 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取各试验项下提取液，摇匀，滤过，即得。

2.1.4 阴性溶液制备 按处方比例，取缺黄连饮片和黄柏饮片的其余药材，按供试品溶液制备方法，制备阴性溶液。

2.1.5 专属性试验 分别取以上对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液，按照上述色谱条件测定，结果表明，指标成分色谱峰分离度好，阴性无干扰。色谱见图1。

注：A：对照品溶液色谱；B：供试品溶液色谱；C：阴性溶液色谱

2.1.6 线性与范围试验 分别精密量取“2.1.2”项下对照品溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.112、0.224、0.336、0.448、0.560、1.12 mg/mL的对照品溶液，按照上述色谱条件测定，以浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=40000000X+449157(r=0.999 6)，表明盐酸小檗碱在0.112～1.12 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 取同一份对照品溶液，连续进样6次，进行测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.31%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，进行测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为2.53%，表明该方法的重复性良好。

2.1.9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h进行测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.80%，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.10 加样回收试验 精密量取已知含量的供试品溶液6份，取盐酸小檗碱对照品适量，按1∶1的比例加入，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行测定，计算回收率。结果盐酸小檗碱的回收率为98.47%，RSD为3.34%，表明该方法准确度良好。

2.2 干膏得率测定

精密移取提取液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算干膏得率。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

2.3.1 单因素试验 以盐酸小檗碱含量和干膏得率为指标，分别考察影响乙醇提取工艺的关键影响因素乙醇浓度、加乙醇量、提取时间、提取次数，确定响应面试验影响因素的水平。

乙醇浓度的影响：按处方比例称取药材，分别加入乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液8倍量，加热回流提取2次，每次1h，过滤，滤液进行含量测定和干膏得率测定(图2)，确定响应面考察乙醇浓度影响因素的范围为60%～80%。

图2 乙醇浓度影响因素试验结果

加乙醇量的影响：按处方比例称取药材，分别加入乙醇浓度为70%的乙醇溶液6、8、10、12倍量，加热回流提取2次，每次1 h，过滤，滤液进行含量测定和干膏得率测定(图3)，确定响应面考察加乙醇量6～10倍。

图3 加乙醇量影响因素试验结果

提取时间的影响：按处方比例称取药材，加入乙醇浓度为70%的乙醇溶液8倍量，加热回流提取2次，每次分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，过滤，滤液进行含量测定和干膏得率测定(图4)，确定响应面考察提取时间影响因素的范围为1.0～2.0 h。

图4 提取时间影响因素试验结果

提取次数的影响：按处方比例称取药材，加入乙醇浓度为70%的乙醇溶液8倍量，分别加热回流提取1、2、3次，每次1 h，过滤，滤液进行含量测定和干膏得率测定(图5)。由图5可知，提取次数2次为最优，因此固定提取次数2次。

图5 提取次数影响因素试验结果

2.3.2 响应面实验设计 根据单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0软件设计冰硼痔疮栓提取工艺因素水平表，以综合评分为指标[11-12]，由信息熵赋权得到组合权重(表1)，按提取工艺试验设计及结果进行试验(表2)，方差分析见表3。

表1 提取工艺权重

表2 提取工艺试验设计及结果

表3 提取工艺方差分析结果

2.3.3 信息熵赋权 参照文献[11-16]，首先列出原始评价矩阵(X)；再将其转换成“概率”矩阵(P)，如下。

根据公式，计算各项指标的Hi，如下。

Hi=(0.9952 0.9977)

根据公式，计算各评价指标的权重系数，如下。

Wi=(0.6816 0.3184)

即原始矩阵加权处理综合指标=X/Xmax×0.06816+Y/Ymax×0.03184。

得到回归方程为：R=0.99+0.075A+0.03C-0.16A2-0.034B2-0.039C2，r=0.980 3表明模型预测性良好，由方差分析可知该模型P<0.000 1，说明该模型具有极显著性。影响因素乙醇浓度P<0.000 1，表明该因素具有极显著性；影响因素提取时间P>0.05，表明该因素不具有显著性；影响因素加乙醇量P<0.05，表明该因素具有显著性。综合分析可知，影响因素的顺序为：乙醇浓度>提取时间>加乙醇量，等高线图和三维曲面图(图6)，综合以上，优选的最佳提取工艺参数修正为：乙醇浓度70%，加乙醇量8倍，提取次数2次，提取时间1 h。

图6 各交互因素等高线和三维曲面

2.4 验证试验

根据以上优选的最佳提取工艺参数，按处方量称取药材饮片，加8倍量70%乙醇，提取次数2次，每次1 h，过滤，滤液按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定含量，按干膏得率测定方法测定干膏得率，计算盐酸小檗碱含量RSD为0.93%，计算干膏得率RSD为2.02%。表明该工艺稳定可靠。

3 讨论

痔疮是我国医学最早发现的疾病之一，关于痔的描述最早见于《山海经·西山经》：“有鸟，名曰栋，食之已痔。”最早记载有关痔疮分类和证候的是《五十二病方》，痔疮的中医疗法主要有清热、凉血、解毒等[17-18]，冰硼痔疮栓能消炎止痛、生肌止血，能够有效缓解各期痔疮疼痛和出血，从根本入手，改善机体的整体状况，且栓剂在肛肠中应用很广，适合临床应用。

黄连性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，可用于治疗湿疹、湿疮等[19]。现代研究表明，其主要活性成分小檗碱、黄连碱、巴马亭和药根碱占总活性碱的95%，小檗碱含量在 50%以上，是其主要抑菌成分[20]。黄柏性寒味苦，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，用于疮疡肿毒、湿疹湿疮等，也含有小檗碱成分[21]。本研究以盐酸小檗碱含量测定为评价指标，同时测定黄连和黄柏的有效成分，并结合信息熵赋权和响应面设计，科学合理地优选冰硼痔疮栓提取工艺，为制剂的后期研究及工业化生产提供实验依据。