孟广超，张艳芳，王选年*

(1.新乡学院生物技术研究中心，河南 新乡 453003；2.郑州大学 生命科学技术学院，郑州 450001)

氨肽酶(Aminopeptidase)是一类从蛋白质肽链N末端选择性切除残基并逐个游离出氨基酸的外切蛋白酶，它可以切除苦味肽氨端的疏水氨基酸，从而脱除苦味，在人们日常生活的实际生产中，多用于食品添加剂来改善食物的风味和口感，提高食品的营养价值[1-3]。随着当前人们对食品风味的要求逐渐变高，氨肽酶的发展广受关注，它在生物活性肽的代谢中扮演着非常重要的角色。其次，氨肽酶在商业上拥有巨大的潜力，通过对蛋白水解产物中苦味肽的水解，并释放游离的氨基酸，从而不仅使得蛋白质水解物的风味和营养价值均得到提高，同时也可以使其加工周期变短[4-5]。

在我国氨肽酶的研究起源早，但是进展缓慢，当前市面上流通的商品化氨肽酶并不多见，且多是与其他蛋白酶的复合品，不仅价格昂贵，而且纯度低[6-7]。最常见的氨肽酶来源是通过米曲霉的固态和液态发酵来制取氨肽酶。氨肽酶的工业化问题仍然是调味品市场目前急需解决的问题。本实验在米曲霉产氨肽酶液态发酵条件的基础上，逐步进行优化，旨在获得最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

米曲霉(Asergillusoryzae)：本实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器

L-亮氨酸-4-硝基苯胺(分析纯)：索莱宝公司；72S分光光度计:美国IBAK公司；其他有机试剂:均为分析纯。

1.1.3 培养基

米曲霉斜面培养基：PDA培养基，将土豆清洗干净，切片，去皮，在沸水中煮20 min，用四层纱布过滤掉滤渣，加入15 g琼脂，于121 ℃灭菌20 min。

液态基础发酵培养基：硫酸铵2.5 g，磷酸氢二钾3 g，氯化钙 0.13 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸亚铁 0.0255 g，蛋白胨5 g，水1000 mL，pH自然，于121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 出发菌株的活化

将米曲霉接种于PDA斜面培养基进行活化，于35 ℃培养3 d，待长满嫩绿色孢子后备用。

1.2.2 孢子悬液的制备

用无菌水冲刷斜面培养基，洗脱斜面的米曲霉孢子，将孢子振荡打散，制成孢子悬液，用血球计数板计数，调整好孢子悬液浓度为107个/mL备用。

1.2.3 液态发酵培养

将调整好浓度的米曲霉孢子悬液接种到基础液态发酵培养基中，在适当条件下摇瓶发酵培养，检测氨肽酶活性。

1.2.4 氨肽酶活性的检测方法

氨肽酶活性的测定采用亮氨酸对硝基苯胺法[8]，取适量发酵液在4 ℃，8000 r/min的条件下离心10 min，取上清粗酶液，并将上清粗酶液稀释适当倍数。取100 μL稀释后的酶液加入1.5 mL pH值为7.2的磷酸缓冲液于40 ℃水浴锅中恒温10 min，使其温度稳定，然后加入100 μL浓度为25 mmol/L的L-亮氨酸对硝基苯胺溶液，反应10 min后，在405 nm下，以未加酶液为对照，测定吸光值。

标准曲线的制备：配制一系列不同浓度的对硝基苯胺溶液，以去离子水做对照，在405 nm下测定波长，以对硝基苯胺的浓度(μg/mL)为横坐标，以不同浓度的吸光值为横坐标，建立标准曲线，得到的标准曲线中R2=0.9992。

酶活的定义[9]：在40 ℃、pH 7.2的条件下，每1 min水解亮氨酸对硝基苯胺生成1 μg对硝基苯胺(pNA)所需的酶量定义为一个酶活力单位。

酶活力计算公式：A×V1×D÷(k×t×V2)。

式中：A为吸光值，V1为反应总体积，V2为酶液体积，D为酶液的稀释倍数，k为消光系数，t为恒温反应时间。

1.2.5 实验设计

假设各个因素之间不存在相互影响的关系，每次实验改变一个因素水平，保持其他因素不变，分别对碳源、氮源、发酵时间、pH值、温度、接种量、转速等影响米曲霉产氨肽酶发酵条件的因素进行考察[10]。

在单因素实验的基础上，采用Plackett-Burman实验，在对影响氨肽酶活性的发酵时间、转速、氮源、碳源、接种量、pH值、温度、摇床转速的单因素中，采用两水平实验的设计确定各单因素对氨肽酶活性影响的显著性[11]。

在Plackett-Burman实验的基础上，采取三水平的Box-Behnken实验设计，采用响应面分析进行对氨肽酶活性影响显著的因素之间的函数模拟，寻找米曲霉产氨肽酶的活性与各因素的函数关系，通过数学的方法，找出米曲霉产氨肽酶活性的最大值，以及米曲霉产氨肽酶活性最大时各因素的水平，确定最佳发酵条件[12-14]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵时间对米曲霉产氨肽酶的影响

图1 培养过程中米曲霉产氨肽酶活性随时间的变化Fig.1 Changes of aminopeptidase activity with time during culture

由图1可知，随着发酵时间的增加，氨肽酶的活性逐渐增加，在50 h时，米曲霉产氨肽酶的活性达到峰值152 U/mL，随后开始下降，因此确定最佳发酵时间为50 h。

2.1.2 碳源对米曲霉产氨肽酶的影响

图2 添加量为1%浓度的碳源对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.2 Effects of carbon sources with 1% additive amount on aminopeptidase activity

由图2可知，在基础培养基中加入各类碳源后，米曲霉产氨肽酶的活性显著下降，甚至几乎丧失，原因可能是加入的碳源基本都是糖类物质，在发酵液中，由于糖类物质营养充分，米曲霉直接进行糖酵解生理生化反应，从而限制了氨肽酶以及其他蛋白酶系的形成，因此在本次实验中不添加其他碳源。

2.1.3 氮源对米曲霉产氨肽酶的影响

图3 添加量为1%浓度的氮源对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources with 1% additive amount on aminopeptidase activity

由图3可知，在添加了氮源之后，米曲霉产氨肽酶的活性显著提高，无论是哪种氮源，都能对其活性有促进作用，其中对氨肽酶活性影响最大的是牛肉膏，活性能达到453 U/mL，因此确定本次实验最佳的氮源为牛肉膏。

图4 牛肉膏添加量对米曲霉产氨肽酶的影响

由图4可知，随着牛肉膏浓度的增加，米曲霉产氨肽酶的活性也在增加，在添加量为1.8 g/L时，活性达到最高的461 U/mL，继续增加牛肉膏的添加量，氨肽酶活性慢慢下降，表明过高浓度的氮源并不能一直提高米曲霉产氨肽酶的活性，因此本次实验选择牛肉膏的添加量为1.8 g/L。

2.1.4 pH值对米曲霉产氨肽酶的影响

由图5可知，随着pH值的升高，米曲霉产氨肽酶的活性逐渐升高，在pH值为6.5时，氨肽酶活性达到最高的475 U/mL，随后开始下降，原因可能是米曲霉为一种偏酸性的霉菌，其理想的生存环境的pH为3～7，其代谢环境与其生存环境基本相同，pH值大于其生存环境，会影响米曲霉的生长，进而影响其产酶的代谢，因此确定本次实验的最佳pH值为6.5。

图5 pH值对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.5 Changes of aminopeptidase activity with pH values

2.1.5 温度对米曲霉产氨肽酶的影响

图6 温度对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.6 Changes of aminopeptidase activity with temperatures

由图6可知，随着温度的升高，米曲霉产氨肽酶的活性逐渐升高，在36 ℃时达到最高的477 U/mL，随后开始下降，因此确定本次实验的最佳温度为36 ℃。

2.1.6 接种量对米曲霉产氨肽酶的影响

图7 接种量对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.7 Changes of aminopeptidase activity with inoculation amount

由图7可知，随着接种量的增加，米曲霉产氨肽酶的活性逐渐增加，在接种量为2.5%时，米曲霉产氨肽酶的活性达到最高的481 U/mL，随后下降。原因是随着接种量的增加，米曲霉菌落的数量逐渐增加，氨肽酶活性逐渐升高，但是随着接种量继续增加，由于营养物质有限，米曲霉生长受到抑制，所产活性自然下降，因此本次实验选取接种量为2.5%。

2.1.7 转速对米曲霉产氨肽酶的影响

图8 转速对米曲霉产氨肽酶的影响Fig.8 Changes of aminopeptidase activity with rotating speed

由图8可知，米曲霉产氨肽酶的活性随着转速的变化呈波浪形变化，在180 r/min时，能获得最大值,为481 U/mL，因此确定本次实验的最佳转速为180 r/min。

2.2 Plackett-Burman实验确定影响米曲霉产氨肽酶的显著因素

在单因素实验的基础上，利用软件Minitab进行Plackett-Burman实验设计，通过两水平的实验方法，确定各因素对氨肽酶活性影响的顺序，筛选出影响显著的因素，实验设计因素水平及结果见表1和表2。

表1 Placket-Burman实验因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman experiment

表2 Plackett-Burman实验设计及其响应值Table 2 Plackett-Burman experimental design and response values

表3 各因素显著性及其效应值分析Table 3 The analysis of significance of each factor and its effect value

由表3可知，在各影响因素中，pH值、温度、牛肉膏添加量、发酵时间对酶活为正效应，转速和接种量对酶活为负效应，各因素对酶活影响的显著性为pH值>温度>牛肉膏添加量>接种量>发酵时间>转速，根据对氨肽酶活性的显著性关系，选取pH值、温度、牛肉膏添加量这3个因素进行响应面分析，进一步进行优化。

2.3 Box-Behnken实验优化氨肽酶液态发酵条件

在Plackett-Burman实验的基础上，根据Box-Behnken实验原理，选取牛肉膏添加量、温度和pH值为自变量，以氨肽酶活性为响应值，设计三因素三水平Box-Behnken实验，利用软件进行响应面分析。各因素的编码水平以及Box-Behnken实验设计和结果见表4和表5。

表4 各变量的因素水平Table 4 The factors and levels of each variable

表5 Box-Behnken实验设计和结果Table 5 Response surface experimental design and results

对实验数据进行响应面回归分析，得到3个变量(A,B,C)与氨肽酶活性(Y)的回归关系式为Y=484.2+8.63A+6.63B+3.5C-3AB+9.75AC+3.75BC-16.35A2-43.35B2-29.6C2。

表6 回归模型方差分析Table 6 The variance analysis of regression model

由表6可知，3个因素中pH值(P=0.0172<0.05)和温度(P=0.0486<0.05)对氨肽酶活性的影响显著，牛肉膏添加量(P=0.2483>0.05)对氨肽酶活性的影响不显著。在交互项中，AC对氨肽酶活性的影响显著，AB、BC对氨肽酶活性的影响不显著，整体回归模型的P值=0.0001<0.05，模型效果显著，失拟项的P=0.0702>0.05，效果不显著，表明模型没有失拟现象，二次项的修正系数为R2=0.9379，表明该方程能在93%的水平上表示发酵产酶水平，模型可信度高。

pH值、温度和牛肉膏添加量3个因素及其交互作用的产酶影响可以通过响应曲面图直观反映出来，在各因素对酶活影响的两两交互作用中，各个组合中响应值的最高点均落在实验的考察区域内。

由回归方程模型预测可知，当pH值为6.645，温度为36.28 ℃，牛肉膏添加量为1.844 g/L时，氨肽酶的预测值最高，可达Ymax=492.883 U/mL，考虑到实际培养条件和操作问题，选取pH为6.5，温度为36 ℃，牛肉膏添加量为1.8 g/L进行验证性实验，实验重复3次，取平均值，测得的最终氨肽酶活性为479.22 U/mL，与理论预测值相差2.3%，较未优化前提高了298%。

图9 温度和pH值对氨肽酶活性影响的响应面图及等高线图Fig.9 The response surface and contour plot of temperature and pH value on the activity of aminopeptidases

图10 牛肉膏添加量和pH值对氨肽酶活性影响的响应面图及等高线图Fig.10 The response surface and contour plot of beef extract additive amouat and pH value on theactivity of aminopeptidases

图11 牛肉膏添加量和温度对氨肽酶活性影响的响应面图及等高线图Fig.11 The response surface and contour plot of beef extract and temperature on the activity of aminopeptidases

3 结论

在单因素研究的基础上，利用Plackett-Burman实验设计和响应面研究的方法对米曲霉液态发酵产氨肽酶活性的影响因素进行探究。通过Minitab和Design-Expert 8.0软件进行实验设计，结果表明当pH值为6.645，温度为36.28 ℃，牛肉膏添加量为1.822 g/L时，预测酶活最高为485.883 U/mL，取pH值为6.6，温度为36 ℃，牛肉膏添加量为1.82 g/L时，验证酶活为479.22 U/mL。为获得酶制剂的制备及在发酵过程中的应用提供了借鉴，对我国氨肽酶的国产化提供了理论支持，为食品发酵工业下脚料的高附加值转化提供了理论支持。