龚绍慧，鄢腾峰，吕世刚，叶敏华，吴淼经，祝新根

(南昌大学第二附属医院神经外科，南昌 330006)

胶质瘤常见于成年人，是中枢神经系统最为恶性的原发性肿瘤[1]。在过去的10年中，胶质瘤的治疗方式主要是手术治疗和联合放化疗[2]。随着分子生物学的发展，对胶质瘤发病机制得到了进一步的认识，在胶质瘤的分子研究中已描述了几种遗传和表观遗传学的改变[3-4]。因此，探索更多新的潜在分子机制对于胶质瘤的分子治疗有着重要意义。本研究探讨miR-586对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 样本及细胞系

人脑组织标本包括6例非肿瘤脑组织和30例胶质母细胞瘤脑组织标本，均来自南昌大学第二附属医院神经外科，经患者及家属知情并签署知情同意书后，将标本留取并放在液氮罐中冻存。本研究经本院医学伦理学委员会同意。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组

取出在液氮中冻存的胶质瘤细胞及人正常星形胶质细胞，用含10%血清的培养基于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培养，当细胞贴壁生长至70%～80%时进行细胞传代。选择生长状态良好的U87细胞，按照Lipofectamine 3000试剂(美国Invitrogen公司)说明书进行转染，在培养24～48 h后进行下一步实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR实验

按照PCR试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)说明书进行实时荧光定量PCR实验，得到各组循环阈值(CT值)，以GAPDH作为内参基因，计算2-ΔΔCt值。

1.2.3 CCK-8实验

按照每孔2000个细胞种植在96孔板中，按照CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书，分别在0、24、48、72、96 h时，在对应孔中加入CCK-8试剂，并在酶标仪上设定CCK-8检测参数(450 nm波长处的吸光度)后，重复测量3次吸光度，绘制生长曲线，并进行统计分析。

1.2.4 细胞周期实验

取细胞状态良好，并且处于对数生长期的细胞消化，按照细胞周期试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)说明书，加入完全培养基终止消化；离心，加入完全培养基轻轻吹打重悬，用移液枪将重悬液吸入六孔板中，48 h后收集细胞。吸取PBS洗涤2遍，消化细胞，1500 r·min-1离心5 min，弃上清。用PBS洗2遍，1500 r·min-1离心5 min，弃上清，用残余的液体重悬细胞。用-20 ℃预冷的75%乙醇重悬细胞，封口膜封闭流式管管口，-20 ℃保存过夜。1 mL PBS洗1遍，1500 r·min-1离心5 min，弃上清。加入200 μL的DNA staining solution,震荡10 s，室温避光孵育30 min。流式细胞仪上机检测，对实验数据进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，数据为至少3个独立实验的均值。组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质母细胞瘤组织和非肿瘤脑组织中miR-586表达的比较

实时荧光定量PCR实验显示：miR-586在胶质母细胞瘤组织中的表达显著高于非肿瘤脑组织中的表达(P<0.001，图1A)；胶质瘤细胞系中miR-586的表达水平也高于正常人星形胶质细胞中的表达，其中U87细胞中miR-586的表达水平显著高于人正常星形胶质细胞(P<0.05,图1B)。

2.2 下调miR-586表达对胶质瘤细胞增殖能力的影响

CCK-8实验显示：使用miR-586 inhibitor转染U87细胞抑制miR-586表达后，U87细胞的增殖能力明显下降(P<0.01，图2)。

2.3 下调miR-586表达对胶质瘤细胞周期的影响

细胞周期实验显示：使用miR-586 inhibitor转染U87细胞抑制miR-586表达后，U87细胞周期处于G0/G1期细胞数量明显增加，处于S期减少(P<0.01，图3)。

3 讨论

胶质瘤起源于前体细胞和神经胶质细胞，由于广泛的颅内侵袭性，患者2年生存率较低[5-6]。随着分子生物学的发展，在分子层面探究更多的肿瘤治疗靶点十分必要。有研究[7-8]表明，miRNA在疾病进展(包括肿瘤发生和肿瘤进展等)中，是涉及这些生物过程的关键调节因子。并且miRNA可以在多个方面影响生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡[9]。

本研究聚焦于miR-586对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。实验结果表明抑制miR-586能够导致U87细胞增殖能力明显下降。YANG等[10]发现抑制miR-586的表达能够诱导骨肉瘤细胞阻滞在G0/G1期，过表达miR-586则得出了相反的结论。本研究也得出了同样的结论，通过构建miR-586 inhibitor质粒降低miR-586的表达，发现抑制miR-586能将U87细胞周期阻滞在G0/G1期(图3)。这也再次表明抑制miR-586能够影响肿瘤细胞周期阶段。有研究[11]报道，miR-181a和miR-181b在人胶质瘤细胞中作为肿瘤抑制因子发挥作用。相反，在胶质瘤细胞瘤患者中发现miR-1238高表达与替莫唑胺耐药显著相关[12]。因此，miRNA的失调被认为是胶质瘤治疗的一个方向。

综上所述，本研究对miR-586在人胶质瘤中表达和对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响进行探索，发现miR-586在胶质瘤组织和细胞中表达上调，抑制miR-586的表达可以抑制胶质瘤细胞增殖并诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，为胶质瘤分子治疗提供了新的方向。明确miR-586影响胶质瘤的机制还需要更进一步的探索研究。