谢恩耀，金 琎

（1.康师傅控股中央研究所，上海 201403；2.苏州科技大学化学与生命科学学院，江苏 苏州 215009）

铁皮石斛具有养阴润肺、利湿消肿、缓解神经衰弱等作用，主要产于我国的江浙地区，生长条件较为苛刻，发育过程迟缓，组织培养技术是解决其资源问题最有效的途径[1]。近年来，张启香等对石斛类原球茎进行液体培养的研究，并建立完善了石斛的液体培养技术[2]。

铁皮石斛种子、原球茎、幼苗茎段均可作为外植体进行组织培养[3]。目前较为成熟的技术体系为：外植体→原球茎→愈伤组织→丛芽→苗子[4]。培养基是组培过程中植株生长发育营养的来源，是组培成败的关键因素。本研究选取性状优良的铁皮石斛作为试验组培外植体材料，进行原球茎的诱导试验，对铁皮石斛原球茎培养基的生长因素进行分析筛选，并对其组培增殖体系进行系统地论证及优化，为铁皮石斛的资源化发展及快繁技术提供有效的技术支撑及保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料、培养基及激素

试验过程中的组培苗选自上海市农业科学院育苗基地，采用铁皮石斛种子进行萌发并选育出表现形状较为良好的幼苗。试验过程中的相关试剂均依据文献进行相关母液及激素的配置[11]，试验所用的试剂均购自国药集团。

1.2 培育条件

光照时长控制在12 h/d，光照强度1 000～1 200 lx，培养过程中的环境温度为25±1℃，培养基均分装好后进行灭菌处理以减少分装过程中的污染，灭菌前培养基pH=5.8[5]。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

根、茎、芽均取2 cm，试验过程中处理3组平行，置于相同的培养条件下，50 d后对其成果率和污染率进行记录，确定最佳灭菌方案。具体处理见表1，灭菌结果见表2。

表1 铁皮石斛外植体灭菌方法Tab.1 The sterilization methods for explants of Dendrobium officinale

从表2中污染率和成活率的对比可知，灭菌效果最好的最别分别是编号8、5、6，根、茎、芽的污染率依次为5%、3%、2%；成活率最高的是编号5、8、1成活率为98%、97%、93%。

表2 不同方法的灭菌结果Tab.2 The sterilization results of different methods

2.2 原球茎的诱导

2.2.1 培养基的选择

铁皮石斛根、茎、芽分别接种至MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS 4种基本培养基中30 d，诱导出原球茎的顺序依次为茎部、根部和芽。且MS培养基诱导培养率最高，依次为90%、80%和70%；比较发现，MS培养基诱导产生铁皮石斛生长的速率及增值质量明显高于1/2MS、1/4MS、1/8MS培养基（见图1）。

2.2.2 激素的选择

原球茎诱导过程中激素发挥着重要的作用，依据相关文献资料可知，6-BA处理后可诱导愈伤组织的形成，KT可促愈伤组织分化，NAA、IBA、2,4-D等对生长具有促进作用[5]，实验过程中选取6-BA、NAA、2，4-D3种对诱导影响相对较大的激素进行正交试验分析，进而得到不同种类的激素搭配比例对于愈伤组织生长过程所产生的影响。其结果如表3所示。

表3 原球茎诱导正交实验Tab.3 The orthogonal experiment of protocorm induction

其中，MS+6-BA（0.4mg/L）+NAA（0.8mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L琼脂+3%蔗糖在铁皮石斛原球茎诱导过程中的诱导率最高，其最终诱导率为89%。极值R分析结果表明6-BA、NAA、2，4-D对其诱导影响次序为6-BA>NAA>2,4-D，对K值进行分析可知最优的搭配方案为A2B3C1与表中6号组相吻合，因此原球茎诱导的最佳培养基为：MS+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L琼脂+3%蔗糖，其培育结果如图2中所示。

试验发现，当2，4-D施加浓度过高后会导致培育的愈伤组织出现黄化或者褐化的现象，试验设置不同2，4-D的浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1）对其进行相关培养，研究结果发现，当2，4-D的施加浓度高于0.6 mg/L时，部分培育中的原球茎出现黄化现象，2，4-D的施加浓度越高，其培育过程中越容易死亡，这与罗吉凤等及侯艳霞等研究所得出的结果相一致[7,8]。

2.3 原球茎增殖

在上文基础上建立并优化铁皮石斛原球茎的组培增殖体系，旨在提高其组培繁殖速度。

2.3.1 激素的选择

试验选取KT、NAA、2，4-D 3种对原球茎增殖过程影响相对较大的激素进行正交试验分析，进而得到不同种类的激素搭配比例对于原球茎生长过程所产生的影响。结果如表4所 示，其 中MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L琼脂+3%蔗糖在铁皮石斛原球茎增殖过程中的增值倍数最高，可达到3.5倍的增殖效果。极值R分析结果 表 明KT、NAA、2，4-D、琼 脂 对 其 诱 导 影 响 次 序 为2,4D>NAA>KT>琼脂，对K值进行分析可知最优的搭配方案为A2B3C1D2、A3B3C1D2，其中A2B3C1D2与表中6号组相吻合，后续试验对A3B3C1D2进行试验验证得到3.0的增殖倍数，与A2B3C1D2的3.5倍增值倍数相比略低，因此6号组为原球茎增殖的最佳配比，其培养基配方为MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20g/L琼脂+3%蔗糖。

表4 原球茎增殖过程激素正交实验分析Tab.4 The orthogonal experiment analysis of hormones in the process of protocorm proliferation

2.3.2 不同氮磷比对原球茎增殖的影响

氮和磷是MS母液中的大量元素，植物顺利的培养与氮和磷这2种元素关系密切。王光远等对铁皮石斛花芽进行组织培养过程中研究发现，MS中硝酸钾和磷酸二氢钾的浓度对芽繁殖在一定程度上具有抑制作用[8]，其具体表现为KNO3和KH2PO4在组培过程中的添加浓度越高，其组培植物的增殖系数则会越低。

原球茎在MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L琼脂+3%培养基含有不同氮磷比的条件下培养50 d，每隔15 d对其增殖鲜质量进行相关统计，如表5所示，通过表5可以看出在KNO3和KH2PO4浓度为950 mg/L、350 mg/L时，其增殖倍数可达到最高为1.07倍，经统计分析可以直观发现KNO3和KH2PO4的浓度越高，增殖倍数越低，与王光远等人的实验结果相吻合。

表5 不同氮磷比对原球茎增殖影响Tab.5 The effects of different nitrogen and phosphorus ratios on the proliferation of protocorm

2.4 原球茎的悬浮培养

在试验过程中原球茎通过悬浮培养的模式进行细胞扩增其结果相较于传统的固体培养基培育模式可以获得更加优异的效果。本研究在不同的培养基上设计差异化的激素比例从中筛选出最佳的悬浮培养基配方。

2.4.1 培养基组成的筛选

分别在MS、B5、1/2MS中添加3%蔗糖、0.4 mg/L 6-BA、0.8 mg/L NAA，选择生长一致的原球茎进行培育，每15 d记录一次，50 d后统计其鲜质量。

从表6中可以看出，采用悬浮培养的方式对原球茎进行培养的过程中，B5培养基中培养其增殖倍数可以达到最高，达到了3.45倍，含糖量可达9.56%。经试验论证最优的培养基确定为B5+3%蔗糖+6-BA+NAA。

表6 不同培养基对原球茎增殖和多糖所产生的影响Tab.6 The effects of different media on the proliferation of protocorm and polysaccharides

2.4.2 不同激素含量对悬浮培养的影响

以B5+6-BA+NAA+3%蔗糖为基本培养基，培养50 d，期间记录其鲜质量值，据鲜质量值选择最优的培养激素比例。从表7中可以看出随着培养时间的提高，原球茎的鲜质量呈上升趋势，在NAA浓度为0.2 mg/L时，当6-BA浓度为0.4 mg/L，原球茎鲜质量均达到2.86 g；在6-BA浓度为0.2 mg/L，NAA浓度为0.4 mg/L时，原球茎鲜质量达到2.81g；6-BA浓度为1 mg/L，NAA为1 mg/L，原球茎的鲜质量为1.79 g。结果表明，在NAA施加浓度较低时，适当提高6-BA的浓度，可以有效促进其增殖效果。在6-BA浓度较低时，适当提高NAA浓度，反而对其增殖具有一定的抑制作用。

表7 不同激素含量对原球茎悬浮培养的影响Tab.7 The effects of different hormone content on suspension culture of protocorm

3 结论

本研究采用种子萌发后所挑选获得的性状优良的铁皮石斛为组培外植体所需的材料，诱导原球茎产生，并对铁皮石斛原球茎培养基的关键因素进行分析筛选，对铁皮石斛原球茎的组培增殖体系进行了相关的完善及优化，通过对铁皮石斛组培过程中生长发育的几种关键因素的研究从而确定了不同培养状态下的最优培养基，分别论证了诱导过程、增殖过程、液体悬浮培养过程，从而为铁皮石斛的大规模化人工培养方式提供了切实可行的数据支撑。

综上所述，在组培过程中基础培养基和激素均会对植株的培育过程产生较为显著的影响，通过大量的正交实验及对比分析最终所得到的优化方案为：

（1）原球茎诱导过程最优培养基配比方案为：MS+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L琼脂+3%蔗糖。

（2）原球茎增殖过程最优配方为：MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20g/L琼脂+3%蔗糖。

（3）悬浮培养最优配方为：B5+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）+3%蔗糖。

在培养基的变更过程中经过相应的研究发现氮磷比对于组培植物有着较为显著的影响，组培过程中随着KNO3和KH2PO4在基础培养基中含量的逐渐升高，其组培植物的增殖系数会出现显著的降低。