红豆杉资源提取紫杉醇技术进展

2021-01-08韩木先祝剑峰王祖才姚敏敏

化工设计通讯 2021年11期

韩木先，祝剑峰，李辉，王祖才，姚敏敏

（湖北生态工程职业技术学院生态环境学院，湖北武汉 430200）

紫杉醇是一种天然抗癌活性物质，被用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，同时也在研究与其他抗癌药物联用的治疗方法，是获得FDA 批准的第一个来自天然植物的化学药物[1]，其临床应用范围正逐步扩展[2]。

当前，只发现紫杉醇天然存在于红豆杉属和澳洲红豆杉属植物中，且它们紫杉醇含量极低，仅仅为干质量的0.005% ～0.07%，而且不同的植物种属以及不同的植物器官含量有较大差异[3]。因为红豆杉类植物生长特别缓慢，紫杉醇在树皮中的含量最高，但红豆杉树剥了树皮会死亡。要获取天然紫杉醇，需要新剥取树皮等植物组织，再提取，如从砍伐树木、收集、分离、萃取紫杉醇，人力物力财力耗费极大，消耗森林资源，难产业化。因天然紫杉醇提取难实现产业化，从植物中提取代价太高，紫杉醇原料来源不足，寻找新的植物资源、新技术迫在眉睫。利用红豆杉资源提取紫杉醇的技术，迄今为止已经探索出利用生物技术的离体培养法、内生菌培养法、微生物转化法等多种方法获得紫杉醇[1，4-5]。近年来，如何获取红豆杉资源和得到紫杉醇的新技术，已成为研究热点。

1 离体培养法

离体培养，又称植物组织培养或植物无菌培养，是利用植物离体的器官、植物组织或植物细胞以及原生质体等，通过无菌、人工培养基及适宜温度等条件诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后得到植株的技术。

离体培养法是得到紫杉醇的重要方法，也是合成前体紫杉醇来源的一重要技术，因其无污染、不破坏自然资源及不受自然条件的限制，得到迅速发展。

1.1 细胞培养法

细胞培养法指通过体外模拟体内环境，使细胞生存、生长、繁殖，该方法能维持细胞主要结构和功能[6]。

研究表明，早在 20世纪70 年代，针对欧洲红豆杉，早有胚培养的研究。Zeldin等的研究结果显示，大量的研究集中在红豆杉的细胞培养上，培养的种或变种大部分已证实有紫杉醇产生[7]。美国 Christen等于1989年，已通过对太平洋红豆杉细胞培养生产出紫衫醇[8-9]。不久以后，日本、德国和韩国等相续报道了可以通过细胞培养的技术，获取高含量的紫杉醇。梅兴国等的研究显示，通过对比研究两相培养系统中红豆杉细胞的生长与代谢规律，40d培养后，紫杉醇的产量为 30.19mg/L[10]。这些研究显示，红豆杉悬浮细胞大规模培养生产紫杉醇，进而实现产业化，有望实现。赵晶以东北红豆杉为原料，通过检测技术的优化、诱导、高产细胞筛选，建立了细胞悬浮体系，并通过添加代谢调节因子提高细胞悬浮体系中的紫杉醇产量，初步构建了高效获取紫杉醇的技术体系[11]。李纯以东北红豆杉幼茎为材料，在适宜的（补光）环境条件下，对东北红豆杉愈伤组织诱导，然后不断地进行继代培养，选择紫杉醇含量高且稳定的愈伤组织，进行高产细胞株系的筛选，并对细胞悬浮培养条件进行优化，得到一套优化工艺[12]。

由于该方法不受自然条件限制，紫杉醇产量较高等优点，是当今实现紫杉醇工业化生产最有前途的方法。

1.2 发根培养法

发根培养法是离体培养的另一方向，是通过发根土壤杆菌诱导红豆杉细胞，得到发根，然后大量培养，再从中提取紫杉醇[6，13]。Vikas Srivastava等详细介绍了发根培养法的应用、前景、应用案例等[14]。因为发根生长速率快、遗传稳定，并且正常根的分化结构稳定，发根培养法很有希望成为获取产紫杉醇的重要技术。

黄遵锡等的研究结果表明，通过发根农杆菌诱导红豆杉芽外植体，诱导出的毛状根，40d后转化率达到30%。经反应检测，毛状根中的紫杉醇含量达到短叶红豆杉愈伤组织的1.3～8.0倍，过程中，毛状根也分泌了紫杉醇[15]。盛长忠等的研究表明，通过诱导愈伤组织，20d 的愈伤组织对该细菌比较敏感，当感染时间为5min时，冠瘿诱导率达到15.0 %，对冠瘿组织检测显示，有特异的胭脂碱存在并产生了紫杉醇[16]。Katarzyna Syklowska-Baranek等研究了两种前体l-苯丙氨酸和对氨基苯甲酸对红豆杉培养物中紫杉醇的生长和积累的影响，l-苯丙氨酸可使紫杉醇产量从40.3μg/L至568.2μg/L，而对氨基苯甲酸对紫杉烷产量的影响不太明显，紫杉醇产量最高（221.8μg/L）[17]。

该技术前景很好：发根生长速度快，不需要植物激素，有稳定的遗传性，且正常根的分化结构及次生代谢含量高。但当前该工艺尚未成熟，还不足以支撑紫杉醇的工业化生产[18，19]。

2 内生菌法

Stierle等人1993年的研究结果表明，可利用内生植物真菌来生产紫杉醇和相关的紫杉烷，检测结果显示为，产生了紫杉醇，并且是由真菌生成的。随后，他们又分离到一株内生真菌—小孢拟盘多毛孢菌，其发酵水平又比内生植物真菌略高。该研究具有重要研究意义和潜在的商业价值，但紫杉醇含量偏低，近期难以实现商业化生产。Yong-Cheng Li等研究了紫杉醇积累过程中内生真菌与其宿主的相互作用。Zaiyou J等研究用分离出的高效生产紫杉醇的内生真菌，用于紫杉醇的生产，效果良好。

真菌法是近年来研究的热点，但菌种的获得、保存较困难，目前仅可得到微克级的紫杉醇，就商业化生产目标，目前的研究现状，任重而道远。

3 微生物转化法

通过生物酶类的高度选择性，将得到的紫杉醇结构类似的一些紫杉烷类化合物，转化得到紫杉醇的半合成前体，通过简化分离过程，提高了资源的利用率。目前，紫杉醇类似物之间基因修饰以获得更高活性的新化合物，已经成为一个新的研究领域，已有一些以紫杉烷类化合物为底物进行生物转化的、有意义的研究，但该技术还远未成熟，未能达到商业化生产。