郑之俊 肖 伟 梁发俊 章显宝 王 震

安徽中医药大学第二附属医院脑病六科，合肥 230061

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种与衰老密切相关的中枢神经系统退行性疾病，导致该病的因素较多，如遗传因素、环境因素、线粒体功能障碍、氧化应激[1]、兴奋性氨基酸作用等，具体发病机制尚未完全明了。其基本病理变化为黑质致密区多巴胺能神经元及其他含色素的神经元大量变性丢失、残留的神经细胞内嗜酸性包涵体即路易小体的形成，伴有纹状体多巴胺含量显著减少，主要表现为运动迟缓、静止性震颤、肌张力增高等[2]。目前对于PD多首选药物治疗，也有以神经核毁损术为代表的症状性治疗，但均不能取得满意远期疗效。本课题组基于“肠脑轴”理论选取相应穴位针刺治疗PD模型大鼠，观察其对中脑黑质TH蛋白及相关炎症介质表达的影响，旨在探讨针刺对PD治疗作用及其相应作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级SD健康成年雄性大鼠40只，体重220～300 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(皖)2017-001，于安徽中医药大学新安医学重点实验室动物房喂养。将大鼠随机分为针刺组、模型组、假手术组、正常组，每组10只。

1.2 主要试剂与仪器

鱼藤酮(Sigma公司)、DMSO(国药集团化学试剂有限公司)、10%水合氯醛(1 g水合氯醛倒入9 g蒸馏水中配置)、兔抗鼠TH单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，BA1051)、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，BA1054)、β-actin抗体(Zsbio公司，18AV0311)、ECL底物液(Thermo公司，SF249607)、丙烯酞胺(Amresco公司，Exp201609)、甲叉双丙烯酞胺(Amresco公司，Amresc00172)、RIPA裂解液(Beyotime公司，051018180717)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，P0010)、PVDF膜(Milipore公司，R8CA8257E)、一次性无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，0.30 mm×13 mm)。

电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C)、垂直电泳槽(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN)、电转仪(北京六一仪器厂，DYCZ-40)。

1.3 造模方法

参照文献[3]采用鱼藤酮颈背部皮下注射法制备鱼藤酮帕金森病大鼠模型，模型组和针刺组大鼠皮下注射鱼藤酮溶液(1 mg/kg)，假手术组皮下注射1 mg/kg 0.9%氯化钠注射液和DMSO混合液(0.9%氯化钠注射液：DMSO=1：7)，1次/d，连续注射14 d，正常组不进行特殊干预。

造模成功标准参照文献[4]进行判定：造模后大鼠出现典型的毛色变黄变脏，运动迟缓，弓背姿势，反应迟钝，并出现肌强直伴震颤，症状呈进行性加重等表现，即为造模成功。

1.4 干预方法

针刺组取穴为双侧“上巨虚”穴、双侧“天枢”穴及“大肠俞”穴，“上巨虚”取膝关节后外侧，在腓骨头下约10 mm处；“天枢”取大鼠的肚脐眼旁5 mm处；“大肠俞”取大鼠腰部第4腰椎棘突下旁开5 mm。造模成功后，将大鼠四肢固定于自制鼠板上，固定器固定大鼠头部，在其清醒状态下，常规消毒针刺部位后，针刺组大鼠采用0.3 mm×13 mm一次性无菌针灸针斜刺3 mm。每日上午进行针刺治疗，20 min/次，1次/d，7 d为一个疗程，一个疗程结束后休息1 d，共治疗2个疗程。其余各组大鼠自由进食及饮水，抓取、固定时间同针刺组。

1.5 检测指标及方法

各组大鼠均进行行为学爬杆实验[5]，准备一根长60 cm、直径3 cm的圆柱形木杆，外缠医用胶布以保证足够摩擦力。各组实验大鼠安静环境适应15 min后，实验人员手持大鼠尾巴，将大鼠头朝下倒立放于木杆顶端，记录大鼠从木杆顶端爬至木杆杆底时间。大鼠不能抓紧木杆，直接掉落，记为2.0分；大鼠滑行后掉落，记为1.5分；大鼠于木杆上间歇停顿数次爬至木杆杆底，尚可抱紧，记为1分；大鼠呈螺旋状一步一步向下爬行，兼有后肢滑行，记为0.5分；大鼠四肢并用，一次性从木杆顶端爬至木杆杆底，记为0分。

比较各组大鼠黑质区TH、p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达，采用Western blot法进行检测。各组大鼠经相应处理结束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速断头处理，取出大脑，冰面上迅速分离黑质，于-80 ℃冰箱保存。将脑组织放于预冷的玻璃匀浆器中，加入裂解液冰浴匀浆，匀浆液于4 ℃条件下，15 000 r/min离心14 min后吸取上清液。根据蛋白分子量配置成12%的聚丙烯酞胺凝胶电泳；转膜，转膜条件为IL-1β 200 mA，50 min；TNF-α、IFN-γ 200 mA，60 min；TH、p-c-Jun，200 mA，90 min；封闭，用封闭液稀释对应的一抗，将PVDF膜浸泡于一抗4 ℃溶液中孵育过夜。IL-1β、p-c-Jun、TH采用1：200的比例稀释，TNF-α、IFN-γ采用1：800的比例稀释；二抗，用封闭液稀释后，用相应的HRP标记二抗按1：40 000的比例稀释。将PVDF膜浸泡于稀释后的二抗孵育液中，在37 ℃的温度下摇床孵育2 h；显色曝光，放置在X线胶片中压片，之后依次放入显影液和定影液中显影、定影。采用Image J软件对蛋白条带进行分析，以目标条带的吸光度值与β-actin条带吸光度值之比为TH、p-c-Jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 行为学情况比较

针刺组、模型组大鼠在注射鱼藤酮后出现四肢肌张力增高、震颤，毛色干枯稀疏、变黄变脏及拒捕行为减弱等表现，并逐渐加重。正常组及假手术组大鼠饮食如常，喜活动，善打斗，皮毛光滑。

正常组和假手术组大鼠均能够一次性顺利、从木杆顶端爬到木杆底。模型组、针刺组大鼠在注射鱼藤酮7天后，表现为抱杆不稳，甚则坠落，14天后更明显。针刺组大鼠治疗后7天后，虽然爬杆实验仍表现为抱杆不稳，但针刺组大鼠自发性活动增多，较治疗前改善；针刺治疗14天后，针刺组大鼠虽容易滑落，但能够抱杆，较前进一步改善。

2.2 大鼠黑质区蛋白相对表达量比较

与正常组及假手术组比较，模型组大鼠TH蛋白表达明显减少，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达明显增加(P<0.05)。与模型组比较，针刺组大鼠TH蛋白表达明显增加，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达明显减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠黑质区蛋白相对表达量比较

3 讨论

根据本病临床表现，可将其归类于“颤证”、“痉证”等范畴。《灵枢·经脉》记载“胃足阳明之脉，起于鼻之交頞中……循发际，至额颅”，《灵枢·动输》记载“胃气上注于肺……入络脑”，张仲景在《伤寒论》中多次提出阳明腑实证致神志变化；由此可见，胃肠与脑在经脉循行上密切相关，胃肠功能异常可导致神志疾病的发生。中医学认为，脑神与胃肠功能密切相关，这与现代医学中“肠脑轴”观念不谋而合[6]。

“肠脑轴”为大脑与肠道之间功能整合的双向信息交流系统，涉及神经通路、免疫和内分泌机制[7]。唐莉莉[8]、马盈盈[9]等基于“肠脑轴”学说采用相应中医药手段治疗PD患者，发现以肠道为靶点治疗PD，可减轻患者临床症状，改善肠道菌群，调节血液中脑肠肽水平。因此，本研究选取针刺大肠经募穴天枢、大肠经下合穴上巨虚、大肠经背俞穴大肠俞治疗PD模型大鼠，旨在基于“肠脑轴”理论，通过改善胃肠功能来治疗神经系统疾病。

PD的典型病理特征为黑质致密区多巴胺能神经元及其他含色素的神经元大量变性丢失、残留的神经元胞质内出现嗜酸性包涵体。越来越多研究[10-11]表明，神经炎症介导的神经毒性在PD的发生发展过程中发挥重要作用；通过降低炎症因子水平，可以对PD起到一定的治疗作用。有学者[12-13]认为，p-c-Jun是JNK信号通路的活性底物，与炎症反应关系密切，并与PD发病密切相关。TH是多巴胺合成的限速酶，能够有效预防PD等神经退行性疾病的发生，TH表达减少可导致多巴胺的损伤，从而导致PD的发生[14]。

本研究结果发现，与正常组及假手术组比较，模型组大鼠TH蛋白表达明显减少，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达明显增加；表明帕金森病大鼠造模成功后，大鼠黑质区TH蛋白表达上调，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达下调。与模型组比较，针刺组大鼠TH蛋白表达明显增加，p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达明显减少；表明针刺治疗可能通过降低p-c-jun水平，减少炎症介质TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达，增加帕金森大鼠黑质区TH蛋白含量，从而改善鱼藤酮对PD大鼠神经元造成的损伤。与王述菊等[15]的研究结果相一致，表明针刺可能通过调节PD模型大鼠体内MAPK/JNK信号通路，降低p-c-jun在黑质区的表达，减少PD模型大鼠炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的表达，从而对PD的发生发展可起到一定的治疗作用。

综上所述，针刺可下调PD模型大鼠黑质区JNK表达，降低炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平，对PD有一定的调节作用。