王曙东， 马 倩， 王 可,4， 瞿才新， 戚 玉

(1. 盐城工业职业技术学院 纺织服装学院， 江苏 盐城 224005； 2. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215002；3. 江苏金麦穗新能源科技股份有限公司， 江苏 盐城 224005； 4. 青岛大学 纺织服装学院， 山东 青岛 262127)

组织工程支架材料融合了材料工程和生命科学的概念和创新，旨在解决组织的改进、修复和替换问题[1]。为成功地进行组织的修复和再生，支架材料应具有特定形状、三维多孔结构和优异的生物力学特性，并可为细胞的附着、增殖和分化提供支持[2]。蚕丝蛋白因具有良好的生物相容性、生物可降解性以及最小的炎症反应等优异性能，已被制备成多种结构和形态的支架材料，如水凝胶、纳米纤维、薄膜、微球和管状物等，并广泛应用于组织工程的修复与再生[3-4]。目前，静电纺丝法、自组装法、相分离法、气体发泡法、溶胶-凝胶法等技术已被广泛应用于组织工程支架的制备[5]。除上述方法外，3D打印技术以其成型简单、速度快、结构可控、制备工艺更清洁等特点，引起了研究人员的广泛关注[6-8]。

近年来，国内外已有采用3D打印技术制备蚕丝蛋白支架的相关报道。SKANDER等[9]成功地在塑料基板上将蚕丝蛋白水溶液打印成平行线状图案，并将人体骨髓基质细胞种植于该蚕丝蛋白线上，结果表明，细胞可较好地在该蚕丝蛋白线上生长。GHOSH等[10]采用3D打印技术制备了格栅状蚕丝蛋白支架材料，并将打印出的格栅状蚕丝蛋白支架沉积到甲醇溶液中，通过有机醇交联使蚕丝蛋白二级结构转变，从而使蚕丝蛋白水溶液凝胶成型。上述研究表明，蚕丝蛋白已被作为3D打印的潜在材料，并应用于组织工程支架，然而3D打印制备蚕丝蛋白支架材料也面临着挑战，其中关键的问题是蚕丝蛋白的快速成型与凝固，因为快速成型是3D打印蚕丝蛋白支架材料的前提和基础。

在课题组前期研究中，通过电凝胶法制备了蚕丝蛋白水凝胶，并通过有机醇处理和紫外光固化等方法研究了蚕丝蛋白水凝胶的快速成型[11]，但制备过程复杂，且有机醇和光固化剂等可能会对蚕丝蛋白支架材料造成污染。明胶是一种从胶原蛋白中提取的可生物降解的聚合物，其成分和生物特性与胶原蛋白几乎相同，此外，在低温环境下明胶可快速凝胶成型[12]，因此，本文将蚕丝蛋白与明胶复合，制备了蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶，通过明胶来调节蚕丝蛋白的快速成型，通过直写挤出式3D打印技术制备了格栅状蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架，并对其结构与性能进行了研究。

1 实验部分

1.1 实验材料

蚕茧，市售；明胶粉(平均相对分子质量为25 000，化学纯)，溴化锂、碳酸氢钠、无水乙醇、胭脂红、苦味酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；透析袋(截留相对分子质量为7 000)，上海基星生物科技有限公司；MC3T3-E1胚胎成骨细胞，由苏州大学基础医学与生物科学学院提供。

1.2 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的制备

剪碎的蚕茧经脱胶、溶解、透析等过程制得质量分数约为5%的蚕丝蛋白水溶液[13]，并置于4 ℃条件下保存待用。将明胶粉在60 ℃的蒸馏水中溶解，得到质量分数为20%的明胶水溶液。将制备的蚕丝蛋白水溶液与明胶水溶液按照一定的质量比(100∶0、70∶30、50∶50、30∶70和0∶100)混合，得到不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水溶液。

采用自组装的直写挤出式3D打印设备在4 ℃环境下，将蚕丝蛋白/明胶复合水溶液通过打印喷头打印到固定的表面皿上，打印出具有三维周期结构格栅状蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶。打印喷头采用内径为0.9 mm的锥形注射器针头。将打印好的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶置于-20 ℃下12 h后，放置在冻干机中48 h获得冻干支架样品[14]。

1.3 结构与性能测试

采用RS6000型流变仪(德国赛默飞世尔科技有限公司)测定蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的黏度、储能模量(G′)和损耗模量(G″)等流变性能[15]。实验使用的PP20H型平行板直径为20 mm，平行板间距为0.5 mm，在频率为1 Hz和温度为4 ℃条件下进行扫描测试。

采用3365型电子万能试验机(美国英斯特朗公司)测定蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架的拉伸力学性能，并获得相应的应力-应变曲线[16]。

采用Jasco-815型圆二色光谱仪(CD，日本分光株式会社)测定蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的二级结构，扫描波长范围为250～190 nm，扫描速率为100 nm/min。

采用Nicolet5700型傅里叶红外光谱仪(FT-IR，美国尼高力仪器公司)测试蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的红外光谱图，扫描范围为4 000～400 cm-1。

采用X′Pert-Pro MRD型X射线衍射仪(XRD，荷兰帕纳科公司)测试蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的衍射图谱，扫描范围为5°～45°。

采用S-4800型扫描电子显微镜(SEM，日本日立公司)观察冻干后的蚕丝蛋白/明胶格栅状支架的结构。

采用MC3T3-E1胚胎成骨细胞培养来表征蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的生物相容性。将MC3T3-E1细胞分散于培养基内，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，观察细胞的生长状况，当细胞铺满瓶底80%时传代使用。将格栅状蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架高温灭菌后，在支架上种植MC3T3-E1细胞，采用四唑盐比色法(MTT)测定细胞在支架上的生长情况，借助扫描电镜观察细胞在支架上的生长形貌[17]。

2 结果与讨论

2.1 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的流变性能

图1(a)示出蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶在4 ℃下的外观形态。可见：纯蚕丝蛋白呈溶液状态，当蚕丝蛋白与明胶质量比为70∶30时，已呈现凝胶状态；随着明胶质量占比的提高，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的凝胶效果越来越好，其对应的黏度测试结果如图1(b)所示。可见，随着明胶质量比的提高，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的黏度逐渐增加，表明明胶的复合有利于提升蚕丝蛋白水溶液的凝胶成型效果。

图1 不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的外观形貌和流变性能Fig.1 Morphology (a) and rheological property (b) of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratios

为进一步研究蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的凝胶成型性能，测试了它的储能模量和损耗模量，结果如图2所示。当储能模量小于损耗模量时，流体表现为液体状态；当储能模量大于损耗模量时，流体表现为凝胶状态[18]。由图2(a)可见：纯蚕丝蛋白体系的损耗模量大于储能模量，体系呈现为溶液状态，不利于3D打印快速凝胶成型；随着明胶质量占比的增加，复合体系的储能模量逐渐增大，储能模量逐渐大于损耗模量，复合体系呈现胶体状，且随着明胶质量占比的增加，复合体系的胶体性能变好，有利于3D打印过程中的快速凝胶成型。

图2 不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的储能模量和损耗模量Fig.2 Elastic shear and viscous moduli of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratio

2.2 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的力学性能

蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架的拉伸力学性能如图3所示。可见：纯蚕丝蛋白支架的断裂强度较小，为0.87 MPa，断裂伸长率为55.63%；随着明胶质量占比的增加，复合水凝胶支架的断裂强度逐渐增大，断裂伸长率有一定程度的降低；当蚕丝蛋白与明胶质量比为50∶50时，复合水凝胶支架的断裂强度为3.43 MPa，断裂伸长率为45.64%。这可能是由于随着复合水凝胶中明胶质量占比的提高，复合水凝胶的黏度和储能模量逐步增加的缘故。另外，因蚕丝纤维在溶解过程中蛋白质大分子链被切断，分子质量变小，导致明胶蛋白的分子质量高于蚕丝蛋白，也是导致随着明胶复合比例的提高，复合水凝胶的断裂强度逐渐提高的原因。

图3 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的力学性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin/gelatin blended hydrogel

2.3 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的微观结构

蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的圆二色光谱、红外光谱和X射线衍射图谱如图4所示。由图4(a)可见：蚕丝蛋白水溶液的圆二色光谱图在195 nm处有吸收峰，属于蚕丝蛋白silk I结构特征峰，表明其二级结构以无规卷曲为主[19]。蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶在197～198 nm处出现吸收峰，同属于蚕丝蛋白silk I结构特征峰，表明蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的二级结构也是以无规卷曲为主，说明明胶的复合未对蚕丝蛋白的二级结构产生影响。

由图4(b)可见：蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的红外光谱在1 652～1 640 cm-1(酰胺I)和1 537 cm-1(酰胺II)处均有明显的吸收峰，在1 237 cm-1(酰胺III)处有中等强度的吸收峰，表明蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的二级结构主要以无规卷曲为主[20]。此外，纯蚕丝蛋白在酰胺I上的吸收峰在1 652 cm-1处，随着明胶质量占比的增加，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶酰胺I上的特征吸收峰向低波数偏移，且随着明胶质量占比的提高，吸收峰向低波数方向偏移幅度变大；当蚕丝蛋白和明胶质量比为30∶70时，在酰胺I处出现2处特征吸收峰，分别在1 643和1 635 cm-1处，表明随着明胶质量占比的增加，复合水凝胶体系的部分无规卷曲结构向β折叠结构转变，这是由于蚕丝蛋白与明胶形成氢键所致[21]。

图4 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的微观结构图Fig.4 Microstructure of silk fibroin/gelatin blended hydrogel.(a) Circular dichroism spectra; (b) FT-IR spectra; (c) XRD spectra

由图4(c)可见：蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合凝胶XRD图谱均在20.6°附近出现比较宽的散射峰，没有出现明显的衍射峰。表明蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶的复合水凝胶均以无定形结构为主[22]，明胶对蚕丝蛋白的二级结构不产生影响，这与圆二色光谱和红外光谱的分析结果是一致的。

2.4 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的形貌结构

3D打印蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶及其冻干后的支架形貌结构如图5、6所示。由图5可见：纯蚕丝蛋白溶液体系通过打印针头打印出后是溶液状，不能成型；随着明胶质量占比的增加，复合水凝胶的黏度增大，可成功打印出格栅状蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶；当蚕丝蛋白与明胶质量比为50∶50时，可打印出成型较好、线条较规整的复合水凝胶。但随着明胶质量占比的进一步增加，复合水凝胶的黏度进一步增大，不易从针头挤出，成型效果变差(见图5(d))；而纯明胶水凝胶(见图5(e))由于其黏度太大，不易从打印针头挤出。将上述打印好的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冷冻干燥，得到蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架，当蚕丝蛋白与明胶质量比为50∶50时，可得到成型效果较好、线条规整的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架(见图6(c))；随着明胶质量占比的进一步增大，冻干支架的成型效果变差。综上所述，在3D打印蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶时，采用蚕丝蛋白与明胶的质量比为50∶50时较佳。

图5 不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架形貌Fig.5 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels scaffolds with different blended ratios

经冻干后的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架的扫描电镜照片如图7所示。可见：蚕丝蛋白支架及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架均呈现蜂窝状的多孔结构，纯蚕丝蛋白支架的多孔结构较为紧凑；蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架的孔隙尺寸逐步变大，说明明胶的复合在一定程度上改善了复合水凝胶体系的多孔结构，这对后续支架的细胞培养是有利的。

图6 不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干后支架形貌Fig.6 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels freeze-dried scaffolds with different blended ratios

图7 不同质量比的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶冻干支架SEM照片(×100)Fig.7 SEM images of freeze-dried silk fibroin/gelatin blended hydrogel scaffolds with different blended ratios(×100)

2.5 蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶细胞相容性

MC3T3-E1细胞在蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶(50∶50)复合水凝胶支架上培养7 d后的细胞增殖情况如表1所示。可见，MC3T3-E1细胞在2种支架上均可较好地生长和增殖，这是因为蚕丝蛋白具有优异的生物相容性，且支架的多孔结构有利于细胞生长和增殖。细胞在蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架上的增殖情况要好于纯蚕丝蛋白水凝胶支架。这是因为明胶的复合在一定程度上改善了支架的多孔结构，且明胶是一种活性蛋白[23]。细胞在2种支架上培养7 d后的生长情况如图8所示。可见，培养7 d后，MC3T3-E1细胞以层状覆盖于支架的表面，细胞生长状态良好，且细胞在复合水凝胶支架上已连成片状，细胞生长、增殖和分化情况良好，这与MTT分析结果是一致的。上述结果表明，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架具有良好的生物相容性。

表1 MC3T3-E1细胞在蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架上的增殖情况Tab.1 Proliferation of MC3T3-E1 cell on silk fibroin and silk fibroin/gelatin scaffolds

图8 MC3T3-E1细胞在蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架上培养7 d后的扫描电镜照片(×200)Fig.8 SEM images of MC3T3-E1 cell on silk fibroinscaffolds (a) and silk fibroin/gelatin scaffolds (b) after 7 days culturing(×200)

3 结 论

本文将蚕丝蛋白与明胶复合，通过明胶来调节蚕丝蛋白的快速凝胶成型，并通过直写挤出式3D打印装置制备了格栅状蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶，研究了其结构与生物相容性，得出如下主要结论。

1)明胶的复合改善了蚕丝蛋白的流变性能，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶的黏度随着明胶质量比的增加而增加，其储能模量大于损失模量，呈现凝胶状态，有利于后续3D打印过程中的快速凝胶成型。当蚕丝蛋白与明胶质量比为50∶50时，可打印出成型较好、线条较规整的复合水凝胶；但随着明胶质量占比的进一步提高，打印效果变差。冻干后的蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架呈现蜂窝状的多孔结构。

2)蚕丝蛋白的二级结构以无规卷曲为主，明胶的复合对蚕丝蛋白的二级结构并未产生明显的影响，但二者之间存在氢键结合，使得复合水凝胶的部分无规卷曲结构向β折叠结构转变。明胶的复合提升了蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架的力学性能，且随着明胶质量占比的增加，复合水凝胶支架的断裂强度逐渐增加。

3)MC3T3-E1细胞可在蚕丝蛋白及蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架上生长和增殖，蚕丝蛋白/明胶复合水凝胶支架上增殖情况要好于纯蚕丝蛋白支架；培养7 d后，MC3T3-E1细胞以层覆盖于复合支架表面，细胞生长、增殖和分化情况良好。