杨晓贺 魏松红 顾鑫

摘要 为明确东北地区水稻种质资源对纹枯病的抗性，收集了本地区水稻种质资源152份，在苗期和分蘖期进行离体叶片接种;在分蘖末期对79份种质进行了牙签嵌入法接种鉴定。結果表明，供试的152份稻种资源中，苗期离体叶片接种表现抗病的种质有2份，中抗种质有42份。分蘖期离体叶片接种表现抗病的种质2份，中抗种质8份;进行牙签嵌入法接种鉴定的79份种质中，表现中抗的种质16份。在苗期、分蘖期离体叶片接种、牙签嵌入法接种鉴定中均表现为中抗以上的种质仅有‘沈农9819。分蘖期离体叶片接种和牙签嵌入接种法所获结果符合率最高，为77.22%。

关键词 水稻纹枯病; 立枯丝核菌; 离体叶片接种法; 牙签嵌入接种法

中图分类号： S 435.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019435

Abstract In order to clear the resistance of rice germplasm in Northeast China to rice sheath blight （RSB） disease， 152 germplasm resources were collected and identified by detached leaf inoculation at seedling and tillering stage. Two germplasms showed resistance and forty eight germplasms showed middle resistance to RSB with detached leaf inoculation at seedling. Two germplasms showed resistance and eight germplasms showed middle resistance to RSB with detached leaf inoculation at tillering stage. 79 germplasms resources were identified by toothpick-inserting inoculation at late tillering stage， and 16 germplasms showed middle resistance. Among the three identification methods， only ‘Shennong 9819 showed moderate resistance or above. There were the highest coincidence rate of identification results between detached leaf inoculation at tillering stage and toothpick-inserting， with the coincidence rate of 77.22%.

Key words rice sheath blight disease; Rhizoctonia solani; detached leaf inoculation method; toothpick-inserting inoculation method

纹枯病是水稻三大病害之一，对水稻产量可造成10%～30%的损失，严重发病地块损失高达50%[1]。该病的病原菌为立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn，其有性态为瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk，该菌具有较强的腐生性和广寄主性。有关水稻种质资源抗纹枯病的筛选，已有研究者做了大量工作。但抗病性鉴定的方法不尽相同。水稻纹枯病的抗病性鉴定可分为苗期鉴定和成株期鉴定。苗期鉴定多采用可控制温度和湿度条件的雾室鉴定法[2]和微室接种鉴定[3]。其优点是周期短、温湿度可控、发病易于观察。一些研究单位采用该方法进行抗源筛选，但也有研究者认为其鉴定结果与田间实际情况不符，所以放弃此种方法[4]。田间成株期接种方法主要有撒施法[5-6]、稻丛诱发法[7]、菌丝块接种法[8]、牙签嵌入接种法[5]、注射器接种法[9-10]。撒施法和稻丛诱发法的优点是工作量小，操作简单，较适用于基于大田水平的品种选育和抗病性初筛鉴定。菌丝块接种法、牙签嵌入接种法和注射器接种法的鉴定结果重复性高、可靠性更高，适合对材料进行准确鉴定以及纹枯病抗性遗传的研究，其缺点是较为费时、费力，当鉴定材料数量较多时，需要的工作量大。现有的抗源筛选成果中，可供利用的抗源较少，无免疫种质，抗病材料多为中抗品种[11-16]。我国水稻抗纹枯病抗源筛选研究多针对南方水稻种质[17-18]，东北地区水稻抗纹枯病筛选亦有研究[19-20]，但较少。随着东北地区水稻种植面积的扩大、矮秆品种的推广、种植密度及施肥量的增加，纹枯病的发病率呈逐年加重趋势[21]。目前水稻纹枯病已逐渐成为东北地区水稻的主要病害。为明确东北地区水稻种质对纹枯病的抗性水平，本研究收集东北地区水稻种质资源，对其进行苗期和分蘖期的离体叶片接种及分蘖末期牙签嵌入法接种鉴定，对3种接种方法在抗源筛选中的效果进行评价，筛选适合东北地区水稻种植区的抗纹枯病品种，为东北地区水稻育种提供优质的抗纹枯病材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：东北地区水稻种质152份。

供试菌株：水稻纹枯病菌强致病力菌株Y-36由沈阳农业大学水稻病害研究室提供。

1.2 方法

材料种植：所有供试材料种植于黑龙江省农业科学院佳木斯分院水稻育秧棚及试验田内。试验田内每个水稻种质种植2行，行长5 m，田间管理同生产田。

菌种培养：将菌株接种于PDA平板上，28℃活化培养，用直径5 mm打孔器取菌落边缘新生菌丝菌饼，将菌饼放置于PDA平板上28℃培养48 h，用直径5 mm打孔器取菌落边缘新生菌丝菌饼用于离体叶片接种。将灭菌的长1.0～1.5 cm短牙签平铺于未凝固的PDA平板上，待培养基凝固后，将活化后的菌饼接种于该培养皿中，28℃培养5 d，挑取长有菌丝的短牙签用于牙签嵌入法接种。

1.2.1 离体叶片接种法[22]

苗期：水稻4叶期，选取健康叶片剪成6 cm长小段，放置于覆有3层滤纸的直径9 cm培养皿中（培养基及滤纸经高温灭菌），每皿放置4个叶片。叶片中央接种直径5 mm的菌饼，培养皿内加入无菌水配制pH为7的40 mg/L 6-BA溶液保湿。接种后将培养皿置25℃恒温，L∥D=12 h∥12 h的光照培养箱中。接种后24 h调查发病级别，以发病最严重的为最终发病级别，每份种质设3次重复。

分蘖期：水稻分蘖盛期，选取健康叶片，方法同苗期离体叶片接种。接种温度：28℃。接种后36 h调查发病级别，以发病最重的为最终发病级别。

病级标准：参考周而勋等的[22]方法制定离体叶片抗性鉴定标准。

0级（免疫）：无病斑;1级（抗病）：病斑面积占叶片面积的1/8以下;2级（中抗）：病斑面积占叶片面积的1/8～1/4（不包括1/4）;3级（中感）：病斑面积占叶片面积的1/4～1/2（不包括1/2）;4级（感病）：病斑面积占叶片面积的1/2～3/4（不包括3/4）;5级（高感）：病斑面积占叶片面积的3/4以上。

1.2.2 牙签嵌入接种法[23]

分蘖末期，将长有菌丝的短牙签接种于倒数第三叶叶鞘内。接种时应尽量保证不破坏叶鞘与茎秆的原有状态。选取每个单株内长势最强且基本一致的3个分蘖，每份种质选3株。接种后14、21、28 d调查发病级别。以发病最重的为最终发病级别。

病级标准：参照Rush制定并经扬州大学农学院潘学彪研究组修改的0～9级标准[23]及陈宗祥等[24]抗性鉴定标准。

0级（免疫）：植株健康无病;1级（高抗）：病斑在倒6叶鞘上或更低;2级（抗病）：病斑扩展至倒5叶鞘上;3级（中抗）：病斑扩展至倒4叶鞘上;4级（中感）：病斑扩展至倒3叶鞘长度的一半以上;5级（中感）：病斑扩展至倒2叶鞘长度的一半以上;6级（感病）：病斑扩展至倒1叶鞘长度的1/4至1/2范围内;7级（感病）：病斑扩展至倒1叶鞘长度的1/2以上;8级（高感）：病斑扩展至剑叶长度的1/2以上或死亡;9级（高感）：植株或植株中的多数茎秆因纹枯病而死亡。

2 结果与分析

2.1 苗期及分蘖期离体叶片接种鉴定结果

2.2 分蘖末期牙签嵌入法接种鉴定结果

2.3 离体叶片接种同牙签嵌入法接种鉴定结果符合率

将苗期离体叶片接种鉴定结果、分蘖期离体叶片接种鉴定结果、牙签嵌入法接种鉴定结果进行符合率计算，将高抗、抗病、中抗种质归为抗病种质，将高感、感病、中感种质归为感病种质，结果表明，分蘖期离体叶片接种同牙签嵌入法接种结果符合率最高，为77.22%（表3），其次是苗期离体叶片接种同分蘖期离体叶片接种，接种结果符合率为72.37%（表4），苗期离体叶片接种同牙签嵌入法接种结果符合率最低，为64.56%（表5）。

3 结论与讨论

进行离体叶片接种鉴定的种质共152份，在苗期离体叶片接种中，表现为抗病的种质有2份，中抗种质42份，在分蘖盛期离体叶片接种表现抗病的种质有2份，中抗种质有8份。在两个时期的离体叶片接种鉴定中均表现为中抗以上的品种有6份，分别为‘盐804‘生优1号‘WY1368‘松粳19‘长白20和‘沈农9819。在两个时期的离体叶片鉴定中均表现为中感、感病或高感的种质有104份。

从离体叶片接种鉴定的152份种质中挑选出79份种质进行牙签嵌入法接种鉴定，表现中抗的种质有16份，其中，仅有1份种质在苗期和分蘖期的叶片接种鉴定中均表现为抗病，该种质为‘沈农9819。

本研究比较了水稻抗纹枯病鉴定的3种接种方法，分别为苗期离体叶片接种、分蘖盛期离体叶片接种和分蘖末期牙签嵌入接種。将3种鉴定结果进行符合率计算，结果表明，分蘖盛期离体叶片接种与牙签嵌入法接种鉴定结果的符合率最高，为77.22%;其次是苗期离体叶片接种和分蘖盛期离体叶片接种，符合率为72.37%;符合率最低的是苗期离体叶片接种同牙签嵌入接种法，为64.56%。由于牙签嵌入接种法更接近水稻纹枯病的田间自然发病规律，在抗性鉴定中的可靠性更高，在水稻纹枯病抗性机理研究中被广泛应用。从本研究结果来看，分蘖盛期离体叶片接种法更为省时、省力，抗性结果也较为可靠，更适合工作量要求比较大的抗源初步筛选。

采用牙签嵌入法接种进行南方水稻纹枯病抗性鉴定时，通常在分蘖末期接种，抽穗后30 d调查病级来确定最终抗性鉴定结果[25-27]。但由于东北地区冷凉，水稻分蘖、孕穗和拔节等生育进程有重叠，因此接种时间不好确定。此外，一些辽宁的种质种植在黑龙江省佳木斯地区，由于日照变长、温度低，而使其生育期表现延迟，抽穗晚。有些品种甚至无法完成整个生育进程。因此，本研究中采取的抗性鉴定时期并不是南方通用的抽穗后30 d调查标准，而是在接种后14、21 d和28 d分别进行调查，最后以接种后28 d的调查结果为准，同时参考其他研究者采用的抗性鉴定标准[23-24]，确定供试种质的抗性。在接种后28 d时，黑龙江本地品种生育期多为成熟期，病级较高，多表现为感病，仅‘龙稻16表现为中抗。这也表明，该方法中并没有将所有的黑龙江品种淘汰掉，仍然有性状良好的品种表现抗性，可以作为东北地区抗性评价的方法之一。

有研究者认为水稻对纹枯病的抗性同水稻品种的株高、生育期等无显著相关性[28-29]，另有研究者[30]在进行抗纹枯病基因定位的研究中发现，抗性基因的置信区内未检测到株高、生育期等性状的QTL，因此认为水稻对纹枯病的抗性与生育期无关。也有研究者认为[31-32]水稻对纹枯病的抗性可能与生育期有关。本研究中利用牙签嵌入法进行接种鉴定发现，发病重的水稻种质其生育期普遍比发病轻种质的生育期早。因此，水稻种质对纹枯病的抗性可能与其生育期具有一定的相关性。所以，在以后利用牙签嵌入法接种鉴定水稻对纹枯病的抗性时，不同地区水稻种质应在其相应的适宜种植区内进行，以提高鉴定的准确率。

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（责任编辑：杨明丽）