梁 鹏，王剑瑞，崔大方

(华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

益智(Alpinia oxyphylla)为姜科(Zingiberaceae)山姜属(Alpinia)多年生草本植物[1]，主产海南、广东、广西、福建，云南有少量种植[2]，其药用部位为干燥成熟果实[3]，性温味辛，主要用于治疗尿频、崩漏、呕吐等症[4]。现代药理及临床医学研究表明，益智仁含挥发油(主要成分为桉油精、姜烯、姜醇等倍半萜类)、益智仁酮、维生素 B1、维生素 B2、维生素C、维生素E及多种氨基酸、脂肪酸等[5—8]，具有多种重要的药理活性，包括抗衰老、抗痴呆、抗过敏、抗癌以及镇静催眠等[9—14]。

近年来，我国对益智做了大量研究工作，在栽培方面取得了一定进展[15—19]。益智的繁殖一般有种子繁殖[20]和分株繁殖[21]。益智种子为顽拗性种子[22]，极易失水，不利于长时间保存，且发芽率低，发芽不集中，发芽时间长，对良种筛选造成一定的困难。邱燕连等[23]关于益智种子萌发和贮藏特性的研究表明，利用 300～700 mg·L-1GA3和 25 mg·L-1NAA 处理，或将净种子在室温下放置10～20 d后播种，能缩短种子萌发时间，使种子发芽整齐，提高发芽率，但仍然存在发芽不集中、发芽率提高不明显及植物生长调节剂处理浓度不精确等问题。因此，本研究旨在探索益智种子的贮藏特性，及催芽试剂对益智种子萌发的影响，以确定益智种子的最佳催芽方法及贮藏条件，为益智大规模种子繁殖及其优良品种选育提供便利。

1 材料与方法

1.1 材料

益智果实于 2016年 7月采自广东湛江三岭山(以下称广东产)、广西玉林沙田林场(以下称广西产)、海南五指山(以下称海南产)三个种源地，每种源地采集1 kg。果实呈黄色，种子基本成熟。

1.2 方法

1.2.1 种子含水量及千粒重测定

根据国家质量技术监督局农作物种子检验规程(GB/T3543.6)[24]，采用低恒温烘干法测定种子含水量。随机取三种源地益智饱满种子，放入研钵研磨，分别称取2 g放入铝盒中，每个样品重复3次。置于烘箱中(103±2) ℃烘16 h后取出，置于干燥器中冷却，称量。含水量=(鲜重-干重)/鲜重×100%。

种子千粒重采用种子百粒重的方法测定，分别随机取不同产地益智种子1000粒，分10个重复，每重复100粒，称量后取平均值。

1.2.2 种子活力测定

随机选取广东产益智种子900粒，分成两组，每组3份，每份150粒，第一组放入含水量10%湿沙培养皿中，第二组放入干燥空培养皿中，然后分别贮存在3种不同的环境中：冰箱冷冻贮存(-5 ℃～-3 ℃)、冰箱低温贮存(2 ℃～3 ℃)、常温贮存(23 ℃～25 ℃)。每处理每隔30 d，取10粒种子，利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定种子活力，重复3次[25]。以沸水浴煮10 min的种子为对照组。观察样品的染色情况。然后将样品放入研钵中研磨，用60%乙醇溶解样品，将研磨液倒入100 mL容量瓶定容，摇匀。于7200 r·min-1离心10 min。取上清液于分光光度计490 nm处测定吸光度，用于评价种子活力。

1.2.3 种子发芽实验

采用三因素四水平正交试验设计考察产地、温度、浸泡时间对益智种子发芽的影响(表1)。分别取三个种源地种子用KMnO4消毒后晾干，放入垫有双层滤纸的玻璃培养皿中置于培养箱中培养。每处理50粒种子，每处理重复3次，保持滤纸全天湿润，以不浸泡、常温培养种子为对照(CK)。种子发芽以肉眼可见为准。记录发芽率(正常发芽种子占供试种子数百分比)和发芽势(发芽初始日至30 d内正常发芽种子数占供试种子数百分比)。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of soaking treatment orthogonal test

1.2.4 不同生长调节剂处理种子发芽实验

利用不同生长调节剂(6-BA、NAA、GA3)、不同浓度(100、300、500 mg·L-1)处理不同产地种子，按照1.2.3的方法进行发芽实验(表2)。每处理50粒种子，重复3次。以清水浸泡24 h、30 ℃条件下培养种子为对照(CK)。记录发芽率和发芽势。

表2 正交试验因素及水平Table 2 Factors and levels of hormone treatment orthogonal test

1.3 数据处理

数据用SPSS 22.0软件进行单因素ANOVA方差分析、多因素分析、DUNCAN多重比较。

2 结果与分析

2.1 种子千粒重与含水量

测得广西产益智种子含水量 22.06%、千粒重20.08 g，海南产益智种子含水量 21.86%、千粒重19.03 g，广东产益智种子含水量 21.72%、千粒重18.82 g。

2.2 不同贮存方式对种子活力的影响

利用TTC染色法测定种子活力，种胚染色越深则种子活力越大。统计显示，益智种子贮存方式不同，其活力差异显著(表3)。在保湿环境下贮存的各组种子染红数均多于在干燥环境下相同温度贮存的各组种子染红数，但各组种子染红数均随贮存时间延长而减少。

在干燥条件下，低温贮存30 d时，种子活力最高，种子染红数为 8.00；常温贮存次之，种子染红数为 7.67；冷冻贮存种子活力最低，种子染红数为4.67。贮存60 d时，常温组种子活力显著降低，种子染红数为4.67；冷冻组种子染红数降低为3.67；低温组种子活力稍降低，种子染红数维持在 7.67。贮存90d时，低温组种子活力显著降低，染红数为3.67；而常温组与冷冻组种子活力不足 20%。贮存120 d时，常温组与冷冻组种子活力均为0；低温组种子仍有活力，但种子染红数仅 1.33。贮存 150 d时，所有处理种子全部失活。

表3 不同贮存方式的广东产益智种子活力比较Table 3 Vigor of Alpinia oxyphylla seeds from Guangdong Province under different storage conditions

表4 不同温度与不同浸泡时间处理种子发芽结果Table 4 Seed germination results treated with different temperature and soaking time

在湿润条件下，低温贮存30 d时，种子活力最高，种子染红数为 8.67；常温贮存次之，种子染红数为 8.33；冷冻贮存种子活力最低，种子染红数为5.33。贮存60 d和90 d时，常温组与冷冻组种子活力显著降低；而低温组种子活力仍保持稳定，种子染红数保持在8.33。贮存120 d时，低温组种子活力稍降低，种子染红数为 7.33；而常温组与冷冻组种子染红数不足1，种子活力接近0；贮存150 d时，常温组与冷冻组种子全部失活；低温组种子仍有活力，种子染红数为5.33。

综上所述，益智种子在低温湿润环境中可保存较长时间，其最适宜的保存方式为保湿低温贮存。

2.3 不同温度与不同浸泡时间对种子发芽的影响

不同种源地、浸泡温度和时间对益智种子萌发影响的正交实验结果见表4，处理组A1B2C3的种子发芽率和发芽势均最高，分别为58.00%和57.33%。采用直观分析直接得出各因素的主次顺序(表5)，极差(R)越大，表明该因素对试验结果影响越大，该因素也就越重要；反之亦然。极差分析显示，益智种子发芽率、发芽势的影响因素顺序为浸泡温度(B)>浸泡时间(C)>种源地(A)，即浸泡温度(B)是影响益智种子发芽率(R=52.17)和发芽势(R=38.66)的关键因子，其次是浸泡时间(C)，种源地(A)对发芽率(R=2.00)和发芽势(R=6.50)的影响最小。

表5 不同浸泡处理对益智种子萌发指标分析Table 5 Visual analysis of different soaking treatments on germination results

方差分析表明(表 6)，A、B、C因素对益智种子发芽率的影响极显著(P<0.01)； B因素对益智种子发芽势的影响极显著(P<0.01)，种源地(A)和浸泡时间(C)对益智种子发芽势的影响差异显著，但浸泡时间对益智种子发芽势的影响大于种源地的影响。

参试因素对发芽率和发芽势的最优水平处理组合为A1B2C3，即种源地为广东，浸泡温度30 ℃，浸泡时间24 h，与正交试验结果相一致。

2.4 不同植物生长调节剂及其浓度对种子发芽的影响

不同植物生长调节剂处理益智种子的正交试验见表 6。对试验结果进行极差和方差分析，根据极差值(R)判断，影响益智种子发芽因素的顺序为生长调节剂种类(B)>生长调节剂浓度(C)>种源地(A)，即生长调节剂种类(B)对益智种子发芽率(R=20.00)和发芽势(R=16.22)的影响最大，其次为生长调节剂浓度(C)，种源地(A)的影响相对较小。

方差分析表明(表 7)，处理组A1B3C3的种子发芽率和发芽势均最高，分别为88.67%和44.00%。对于发芽率而言，B、C因素的 P<0.01，说明生长调节剂种类(B)和生长调节剂浓度(C)对益智种子发芽率的影响极显著，A因素的P<0.05，说明种源地(A)对益智种子发芽率的影响显著；从发芽势来看，生长调节剂种类(B)因素对益智种子发芽势的影响极显著(P<0.01)，生长调节剂浓度(C)对益智种子发芽率的影响显著(P<0.05)；而种源地(A)对益智种子发芽势的影响不显著(P>0.05)。

综合极差分析和方差分析结果，参试因素对发芽率和发芽势的最优水平处理组合为 A1B3C3，即种源地为广东，赤霉素(GA3)浓度为500 mg·L-1。

表6 不同生长调节剂处理益智种子发芽正交试验结果Table 6 Germination test results of different hormone treatments

表7 不同生长调节剂处理对益智种子发芽的极差和方差分析Table 7 Visual analysis of different hormone treatments on germination results

3 讨论

3.1 贮存方式对益智种子活力的影响

本实验将益智种子分干藏和湿藏两组并分别放置于常温、低温和冷冻三种环境下贮存，湿藏组种子活力明显高于干藏组，表明水分对益智种子活力具有影响。贮存于低温条件的种子活力最高，而冷冻条件的种子活力与对照组种子几乎相同，这与顽拗性种子对低温较敏感的观点一致。

益智种子属顽拗性种子，种子活力与含水量有密切关系。益智种子成熟时种子含水量为20%左右，在采摘10 d后益智种子将严重失水。益智种子难于常规长期保存，短期的保存条件为低温(2～3 ℃)保湿贮存＞低温贮存＞常温保湿贮存＞常温贮存＞冷冻(-5～-3℃)保湿贮存＞冷冻贮存，在低温保湿条件下其贮存时间可长至150 d，种子活力仍然大于50%。

3.2 不同因素对益智种子发芽的影响

环境温度过高或者过低均会影响植物种子活力和种子萌发，适宜的温水浸泡有利种子的破眠及萌发[26]。浸种实验表明，各参试因素对益智种子发芽率和发芽势的影响显著，温度对益智种子萌发的影响最大，其次是浸泡时间，种源地对其萌发影响最小。不同植物种子对萌发温度的要求不同，种子的萌发温度与其具体生境密切相关。30 ℃是益智种子萌发的最适温度，24 h为最适浸种时间，该温度可有效促进其种皮软化，增强吸水能力，种子内相关水解酶活性较高，从而更好地促进种子萌发[27]。本实验中，益智种子在15 ℃时就可萌发，在30 ℃时萌发率最高，45 ℃时萌发率下降，60 ℃时种子全部失活，这可能是由于较高的温度环境对种胚造成一定的伤害，以至种子死亡，最终导致发芽率及发芽势下降。

GA3、6-BA 和 NAA 是常用的种子萌发催芽生长调节剂，不同种子对不同类型植物生长调节剂和浓度的反应不一。研究表明，生长调节剂种类对益智种子萌发的影响最大，其次是生长调节剂浓度，种源地对其萌发影响最小。其中，经不同质量浓度GA3处理的种子发芽率最高，NAA次之，经 6-BA处理的种子发芽率最低。种子的休眠和萌发实际是萌发抑制物ABA与萌发促进物GA3相互竞争的结果。GA3在种子萌发过程中与ABA互为拮抗关系，通过提高各种酶活性加速种子内部物质的分解与合成，从而促进种子的萌发[28]。适宜于益智种子萌发的生长调节剂浸种条件为500 mg·L-1GA3处理，这与邱燕连等[23]的报道相似。