岳娅东 尹盈爱 白桦 张庆 董益阳

1.北京化工大学生命科学与技术学院 北京 100029

2.中国检验检疫科学研究院 北京 100124

随着社会不断地进步与发展，人们渐渐对服装的需求不再仅是保暖、舒服，还希望其更健康、环保。但由于在农作物生长期间反复使用农药杀虫剂[1]，导致纺织品从原料源头到加工成成品的过程中都可能存在农药残留，而有机磷类农药是纺织品中主要残留的农药[2]。残留的有机磷农药对人体健康的危害巨大。据统计，农药中毒有75.4%归因于有机磷农药[3]。有机磷农药可通过经皮吸收等方式进入人体，随后会出现不同程度的中毒症状，会产生呕吐、恶心、视力模糊、呼吸困难等现象，甚至死亡[4]。因此，《生态纺织品技术要求》对纺织品中对硫磷等60 种农药残留量做出了明确规定，要求婴儿产品中农药残留量不超过0.5mg/kg，非婴儿产品中农药残留量不超过1.0mg/kg[5]。

传统的检测有机磷农药的方法有气相色谱法、高效液相色谱法等仪器分析法，此类方法不仅成本高、对操作人员要求较高且样品前处理步骤繁琐[6]。相较于大型仪器检测方法，快速检测技术具有便捷轻巧，成本低廉等优势，且能实现现场检测，目前主要包括免疫分析法、酶抑制法及生物传感器技术等[7-9]。免疫分析法主要利用抗原与抗体的反应，进行有机磷农药的定性和定量检测，其优点是成本低，周期短。本文所采用的就是免疫分析法中比较有代表性的技术——酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），此方法常被用于有机磷农药残留的检测分析中[10]。

本试验以三唑磷、甲基对硫磷、对硫磷为研究对象，利用识别这三种农药的特异性单克隆抗体，建立并优化了酶联免疫的间接竞争检测方法，为快速、经济、高效检测有机磷农药提供了一种新手段。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

三唑磷抗原、对硫磷抗原、甲基对硫磷抗原、三唑磷抗体、对硫磷抗体、甲基对硫磷的鼠源抗体，HRP（辣根过氧化物酶）-羊抗鼠IgG 羊抗鼠-HRP 酶标二抗；多种有机磷农药标准品购买于北京信方源生物科技有限公司；口水巾、毛巾、袜子均购自北京天丰利市场；配制：包被液（0.05M PBS，pH9.6）、稀释液（0.01M PBS，pH7.4）、洗涤缓冲液（0.01M PBST；pH7.4，0.05% 吐温-20）、封闭液（3%的牛血清蛋白）、过氧化物酶底物TMB 显色A、B 液、终止液（2M H2SO4）。

8 通道排枪、电子天平、超纯水器、PH 计、离心机、恒温水浴锅、混匀仪、酶标仪、恒温冰箱、96 孔透明酶标板、移液枪、超声振荡仪、旋转蒸发仪。

1.2 实验方法

（1）间接竞争酶联免疫法（Indirect Competition ELISA，ic-ELISA）检测原理及操作步骤：

原理：包被在酶标板上的抗原与有机磷标准品或样品中的有机磷农药竞争特异性抗体，反应后形成抗原-抗体复合物。若标准品或样品中的有机磷农药浓度低，与包被抗原结合的抗体就多，反之亦然。加入酶标二抗后用底物液显色。显色越浅，吸光度会越小，抑制率越高，则抗体的特异性越强。

步骤：用包被缓冲液将抗原稀释到最佳浓度，每孔100μL加入96 孔板中，37℃恒温2 小时；用移液枪吸取PBST，每孔200μL，加入96 孔板中洗涤3 次；加入封闭液每孔200μL，37℃恒温2 小时；PBST 洗板3 次；用稀释缓冲液将有机磷农药标准品按梯度稀释好，每孔加50μL，再加入稀释好的抗体每孔50μL，摇匀后在37℃下静置30min；PBST 洗板3 次；将稀释好的酶标二抗加入96 孔板中，每孔100μL，37℃下静置30min；PBST 洗板3 次；将底液A 、B 按1：1 比例混合均匀，每孔100μL 加入96 孔板中，37℃下静置20min；吸取终止液每孔100μL 加入酶标板中；用酶标仪在波长450nm 下进行读数，即为OD450 值。

（2）抗原、抗体的最佳工作浓度-棋盘法。酶标二抗的浓度参考说明书用稀释缓冲液稀释为5000 倍。用包被缓冲液和稀释缓冲液分别将抗原抗体进行梯度稀释后，类似棋盘式设计，在酶标板上不加校准物，进行直接ELISA。在450nm 读取吸光度。选择OD450 ≈1.5 为抗原抗体最佳工作浓度。

（3）标准曲线及交叉反应率。将所用的农药标准品分别稀释 为1ppb、5ppb、10ppb、50ppb、100ppb、200ppb， 依 据IC-ELISA 的步骤；将酶标板的第一行设为空白组，即所加农药为0ppb，最后一行设为对照组，即不加农药和一抗，用PBS 来代替以保证与实验组的体积相同，在波长450nm 处读取各吸光度值。重复上述三次，取各平均值，分析数据并计算得出抑制率（%）=[（OD 空白组-OD 实验组）/（OD 空白组-OD 对照组）]×100%，拟合标准曲线。根据曲线拟合得到方程，抑制率50%时为半数抑制浓度IC50，抑制率15%时为检出限IC15。

交叉反应率（Cross Reaction，CR）反映受检物质在干扰物存在下的特异性，交叉反应率越低，抗体特异性越强。用受检物质的IC50 除以干扰物的IC50，即为对照浓度的交叉反应率，即交叉反应率（%）=（受检物质的IC50/干扰物的IC50）×100%。

（4）加标实验。回收率是检验ELISA 方法是否实际可行的一项重要数据，可通过加标实验得到回收率数据。一般认为回收率在70%-120%时，检测方法准确可靠。分别把口水巾、毛巾、袜子洗净用超纯水浸泡过夜，烘干后取纯白色无印花部分1g，剪成5mm×5mm，放入50mL 离心管混匀；加入2μL 的三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷农药原液（100μg/mL），室温静置15min；在离心管中加入20mL 乙酸乙酯，超声20min，将提取液滤出；残渣再用10mL 乙酸乙酯超声5min，将两次滤液合并。将滤液在40℃水浴旋蒸浓缩至干，残留物用1mL5%的甲醇-PBS 溶解，即得200ng/mL 的加标样品用于测定。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

将三唑磷组抗原抗体分别稀释：5000，10000，15000，20000，25000，30000，40000 倍；对硫磷组抗原抗体分别稀释为：2000，4000，5000，8000，10000，12000，15000，16000倍；甲基对硫磷组抗原和抗体分别稀释为：2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，10000 倍。测得吸光度如图1-3。选择OD450 ≈1.5 时，三唑磷组、对硫磷组、甲基对硫磷组抗原抗体的最佳工作稀释倍数分别都是：10000、5000、2000。

图1 三唑磷组抗原抗体浓度优化Figure1 Triazophos concentration optimization

图2 对硫磷组抗原抗体浓度优化Figure2 Parathion concentration optimization

图3 甲基对硫磷组抗原抗体浓度优化Figure3 Methyl parathion concentration optimization

2.2 灵敏度和特异性

用三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷此三对抗原抗体在本试验最佳工作浓度下进行ic-ELISA，测定结果采用logistic 模型拟合四参数方程，标准曲线如图4-6 所示。三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷的检出限IC15 分别为：2.621ng/mL、3.357ng/mL、2.780ng/mL；半数抑制浓度IC50 值分别为：28.468ng/mL、37.787ng/mL、64.185ng/mL。

图4 三唑磷农药与三唑磷抗原抗体标准曲线Figure4 Standard curve of triazophos pesticide and triazophos antigen antibody

本试验分别用多种结构相似的有机磷农药作为干扰物质进行特异性实验，交叉反应率如表1 所示。三唑磷、对硫磷组特异性良好，甲基对硫磷组抗原抗体可识别对硫磷农药，其检出限为3.230ng/mL，半数抑制浓度为99.566ng/mL，交叉反应率为64.465%。

图5 对硫磷农药与对硫磷抗原抗体标准曲线Figure5 Standard curve of parathion pesticide and parathion antigen antibody

图6 对硫磷、甲基对硫磷农药与甲基对硫磷抗原抗体标准曲线Figure6 Standard curve of parathion，methyl parathion pesticides and methyl parathion antigen antibody

2.3 回收率

取制备好的加标样品替代农药标准品进行IC-ELISA 测定，三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷这三种农药在口水巾、毛巾、袜子中的回收率如表2 所示，均在74.620%-108.781%之间。

表1 农药标准品交叉反应率Table1 Cross-reaction rates of pesticide standards

表2 三种纺织品中回收率的测定Table2 Recovery rate of three textiles

3 结语

本实验采用间接竞争酶联免疫法建立了一种快速高效检测纺织品中有机磷农药的方法，所采用的三组抗原抗体灵敏度高，结果满足国家检出标准。其中三唑磷、对硫磷组抗原抗体特异性强，与其它农药无交叉反应。而甲基对硫磷抗原抗体也能识别对硫磷农药，可能是由于甲基对硫磷与对硫磷是相似度更高的同系物，从而也产生较多程度的识别。基于此，本试验不仅为开发有机磷类农药的广谱性抗体提供了依据，并且可以满足纺织品中有机磷农药的快速高效测定。