刘绪兴 ，程 鹏，陈 才，冯 潜，文 章，杨生智，陈 杰

（1.宜宾六尺巷酒业有限公司，四川宜宾 644000；2.劲牌有限公司，湖北黄石 435000）

真菌（Fungus）是真核生物中的一大类群，它与动、植物和其他真核生物并列，自成一界。目前白酒生产中的微生物研究较多的是细菌、酵母、霉菌，其中霉菌和酵母都属于真菌。霉菌亦称丝状真菌，凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌。霉菌分为曲霉属（Aspergillus）、根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Mucor）、青霉属（Paecilomyces）、红曲霉属（Monascus）、犁头霉属（Absidia）、木霉属(Trichoderma)等，它是工农业生产上不可或缺的一类微生物。近年来霉菌在农业、医药、化学、食品等工业中都已广泛应用。酵母菌是一类单细胞微生物，早在殷商时代，酵母菌就成为酿酒必不可少的微生物。酿造中最常见的酵母菌有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、假丝酵母（Candida）、毕赤酵母（Pichia）等。其中酿酒酵母应用最为广泛，假丝酵母次之。各类酵母在白酒、葡萄酒、啤酒、清酒及饮料中都有应用。随着时代的发展，真菌的潜力在不断地被发掘，真菌的应用也慢慢地变成了人们研究的热点[1]。

1 真菌在大曲酒制曲生产中的应用

1.1 真菌在清香大曲制曲生产中的应用

清香大曲是以传统汾酒为典型代表，发酵过程中顶点温度在50 ℃以下的低温大曲，它包括清茬曲、后火曲和红心曲。清香大曲中的微生物主要来源于自然界中，如空气、原料、辅料等。

1.1.1 霉菌

曲房空气中的微生物主要为横梗霉、根霉、毛霉、曲霉等。曲坯的“上霉”有利于保持曲坯的水分，霉菌对清香大曲发酵过程中“上色”也起着关键性作用。随着温度变化，因横梗霉、根霉和黄曲霉数目不同可形成晾红心、火红心、金黄一道线、二道眉、单耳、双耳等现象。

随着科学的不断进步，功能菌强化大曲渐渐进入了人们的视野，将功能菌筛选分离，可得到纯化的优良菌株，并且在制曲过程中发挥着不可忽视的作用。程伟等[2]研究的金种子菌株Mxzd-001 分离筛选出的黑曲霉菌株具有耐酸、耐酒精能力，并且能够产生醇、酯、醛类等风味物质和液化酶、糖化酶等各种酶类。功能菌强化大曲可使大曲的质量进一步提升，在后期酿酒过程中得到更多、品质更好的原酒。马美荣等[3]研究表明，将红曲霉添加到糖化发酵剂，或将红曲霉应用到强化制曲中，可提高出酒率大约2%。

1.1.2 酵母

清香大曲中的酵母是由制曲原料带来的，而研究表明[4]，清香型大曲中酵母菌的优势菌为扣囊复膜孢酵母和酿酒酵母。其中扣囊复膜孢酵母是一类能产生子囊孢子的二形态酵母[5]，是少有的能产生淀粉酶、酸性蛋白酶等水解酶的酵母菌[6]。扣囊复膜酵母在黄酒和米酒及清香型白酒和丢糟方面研究较多，其他酒类较少。扣囊复膜酵母与酿酒酵母的协调作用还可以提高纤维素的利用率，提升出酒率[7]。在酵母菌中，全国各大酒厂都采用生香酵母来提升白酒的品质。生香酵母主要作用是增酯和产香，可以用于任何香型白酒生产，利用现代生物技术筛选分离出优良的菌种可利于大曲质量的提升。其中汾酒厂分离出的汾酒Ⅰ号和Ⅱ号，将其应用于大曲生产，能产生巨大的经济效益[8]。

1.2 真菌在浓香大曲制曲生产中的应用

浓香大曲呈砖状，曲块比小曲大，一般采用小麦、豌豆等为原料，经粉碎加水拌和后压制成砖块状，再经人工控制温度和湿度自然接种发酵而成。浓香大曲发酵过程中顶温一般在55～60 ℃，因此又被称为中温大曲。

1.2.1 霉菌

浓香大曲中的微生物基本都是从自然界中网罗所得，在发酵前期，环境及曲药温度较低，适宜霉菌、酵母的生长繁殖。大曲发酵过程中，“菌丝起引水作用，孢子起着色作用”。菌丝是由外向内生长的，当菌丝长入大曲坯体时，能够促进曲坯内部水分的挥发，因此有“菌丝内插，水分挥发”的培养原理。其次，霉菌还有助于大曲的“穿衣”。研究发现，通过使用0.1‰的大曲生衣复合菌，可以使大曲的穿衣率由原来的20 %～50 %提高至90 %以上，并且还能够提升大曲的质量[9]。另外，采用微生物技术筛选分离出功能菌在浓香大曲中也发挥着出色的作用。姚万春等[10]在优质大曲中，通过筛选分离得到9 株优良菌种，将其制成的大曲，结果表明，无论感官还是理化指标均明显地优于传统大曲，并且能够有效地提高出酒率。在制曲过程添加纯化后的红曲霉、产酯酵母等功能性微生物即可得到强化大曲。强化曲可添加一种或多种微生物功能菌，人工接种与自然接种相结合，增加大曲中功能菌种类及数量。用红曲霉制成强化大曲来提高酯的合成，可以使酯含量在较短的发酵时间内大量提升。

1.2.2 酵母

浓香型大曲中的酵母主要有扣囊复膜酵母、毕赤酵母、卡利比克迈氏酵母、酿酒酵母等，不同地区不同酒企的酵母种类及数量也存在差异。酵母菌品种的优劣很大程度上决定了大曲发酵力的高低。同时发酵力对温度的敏感程度也极高，低温曲发酵力高，高温曲发酵力低，因此筛选出能在高温环境中有着高发酵力的酵母也极其关键。汤有宏[11]在古井贡的高温大曲中分离出1 株能耐高温酵母菌株，将其制成大曲，在高温下仍具有较高的发酵力，将其分离纯化作为功能菌添加到大曲中，就可以人为地控制发酵过程中发酵力的高低。另外通过功能菌培养，还可以得到有利于生产的优良菌株，如蒲春等[12]从洋河大曲中分离得到8 株产酯酵母，其中酶活最高的菌株鉴定为异常毕赤酵母，利用该酵母制备的麸曲酯化力高达19.36 mg/100 mL。胡沂淮等[13]从洋河大曲中筛选出1株能产香的异常毕赤酵母，其发酵培养物具有浓郁的复合香气，风味物质的组分多达27种。

1.3 真菌在酱香大曲制曲生产中的应用

酱香型白酒所用的大曲为高温大曲，即通过润麦、粉碎、加母曲拌和、压制、堆积发酵、入库储存等一系列过程制成的最高温可达60～65 ℃的大曲。酱香型白酒拥有自身独特的风味与高温大曲在制曲过程中微生物发酵及美拉德反应有着密切的联系[14]。

1.3.1 霉菌

高温大曲在发酵过程中顶温极高，而霉菌在低温期可大量繁殖，随着发酵时间的延长，顶温上升后，部分霉菌仍能够耐受高温。霉菌能产生液化酶、糖化酶、蛋白酶等多种酶类，WANG 等[15]从茅台大曲中分离出的微生物群落显示高温大曲中拥有众多霉菌，其中最多的是黑曲霉。黑曲霉能够产生大量的淀粉酶和酸性蛋白酶，在高温环境下仍具有酶活性[16]。班世栋[17]在贵州某酒企对黄曲、白曲以及黑曲3 种大曲的霉菌进行分离鉴定也发现部分曲霉和犁头霉及青霉能够同时产生多种酶活，且活性都较高。

1.3.2 酵母

酱香型大曲顶温较高，很大程度地限制了酵母菌的生长，因此酵母主要的生长繁殖集中在前期的低温培养期，温度较高时，酵母数量急剧减少，后期温度降下来后又会有所上升。虽然酱香大曲中酵母数量并不多，但是并不影响其高度多样性。孔维兵等[18]在酱香大曲中分离出了伊萨酵母属、德巴利酵母属等多种酵母菌，表明酱香大曲中酵母具有高度多样性，对酱香大曲酵母菌的研究也开辟了道路。

2 真菌在大曲酒制酒生产中的应用

2.1 真菌在清香型大曲酒制酒中的应用

清香型白酒是我国白酒四大香型之一，它是以粮谷为原料，经传统固态法发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成的白酒。它具有“入口绵，落口甜，清香不冲鼻，饮后有余香”的固有风格，因此以清香著称[19]。

2.1.1 霉菌

霉菌能产出活性较强的糖化酶，在清香型大曲制酒中的糖化培菌过程起着至关重要的作用。将霉菌制成强化大曲，能够进一步地提升糖化效果，对酒质、出酒率也有明显地提升。牛栏山[20]将从大曲和酒醅中分离出来的米根霉制成米根霉麸曲与大曲结合后，提高了清香大曲的酒质和出酒率。

根霉具有更高的糖化力，更强的适应力及更快的繁殖速度，近几年从黑曲霉中选育出来的宇左美曲霉、沪轻Ⅱ号、UV-11 等都是优良的糖化菌，具有较强的糖化酶活力。

2.1.2 酵母

传统的白酒企业凭借自身多年积累的酿酒酵母、假丝酵母等酵母发酵，其成品酒的质量都较高，但是却存在出酒率低的问题。在增加清香型大曲酒出酒率的研究方面，董家武[21]采用THADY 与糖化酶进行减曲4%和周剑平等[22]采用固定化复合酵母增殖细胞，都能够在不影响原酒风味的前提下，使出酒率提高3%。随着科学的进步，只有通过现代化的生物技术得到高产酯的酿酒酵母才能够从根本上解决酿酒酵母产酯能力的问题。马红霞等[23]的研究表明，添加高产乙酸酯酿酒酵母重组菌株MY15 能够有效地提升乙酸乙酯含量，但是同时也会增加高级醇含量。

研究发现，加入生香ADY，能够在使乳酸乙酯不变的情况下大幅度提升乙酸乙酯的含量，使酒香更协调，口感更佳，增加了优质酒率。而添加THAADY 能够增加酵母菌数量，使原料中淀粉分解更加彻底，提高原料利用率，在提高出酒率的同时还能节约原料，增加经济效益[24-27]。

2.2 真菌在浓香型白酒制酒中的应用

浓香型白酒又称泸型白酒，它以醇香浓郁，甘洌清爽，饮后尤香，回味悠长优美风韵而蜚声中外，饮者甚众[19]。

2.2.1 霉菌

浓香型白酒的主体香味物质是己酸乙酯，而酒质的优劣主要是由己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等物质含量多少及其比例关系来决定的。为了提高白酒的质量，人们对大曲酯化力的研究从20 世纪80 年代后期就开始了[28-29]。许多白酒企业分离出了能够产酯的细菌、酵母和霉菌。其中红曲霉可提高己酸乙酯的含量，研究发现，通过80 d的酯化，己酸乙酯的含量可达7230 mg/100 mL[30]。另外红曲霉加入窖池中，和己酸菌、产香酵母发酵，对比不添加红曲霉的窖池，酯的含量及酒的风味都有明显提升[3]。用酯化酶技术与黄水结合做成酯化液，用来直接勾兑白酒能够提升酒的优质率[31]。红曲霉与根霉一同添加可解决一些传统浓香工艺生产中存在的问题。信春晖[32]的研究表明，在多粮发酵工艺生产中的秋季转排困难时补加红曲霉及根霉能够使发酵正常并提高出酒率，使酒体更丰满。另外，红曲霉还具有一定的糖化力，可产生乳酸、琥珀酸等有机酸，提高白酒风味。

2.2.2 酵母

浓香型白酒中酵母菌主要有酿酒酵母和假丝酵母等。浓香型白酒提高香味物质的现代微生物技术主要有：强化大曲技术、人工老窖技术、香醅制备技术和酯化酶技术[33]。各大酒企纷纷对各自的微生物进行筛选，分离出能够耐高温、高酸及高产量的功能菌。王琛[34]、曾娟[35]、葛隐[36]、汤有宏[11]、王涛等[37-38]均从各大酒厂的糟醅、黄水、窖泥等含菌材料中，通过不同乙醇浓度和pH 条件下定向富集和耐受性筛选的方法得到了能够耐高温、耐高酸的优良酵母菌株。此外，生香ADY、TH-AADY 在浓香白酒生产中能够有效地“增己降乳”，且出酒率和名优酒率都比较高[39-40]。

人工老窖技术、香醅制备技术以及酯化酶技术主要发挥作用的是己酸菌等细菌，真菌在此涉猎较少，不过在此技术上添加酵母，仍有不小的作用。罗惠波等[41]在酯化酶技术的基础上加入耐高温ADY，在提高总酯含量的同时，己酸乙酯上升了9倍。

另外，产酯酵母有助于白酒风味的提升，方心芳教授的研究发现：在己酸发酵液中添加乙醇和产酯酵母，能产生大量的己酸乙酯，提高原酒的名优酒率。施安辉等[42]在山东兰陵美酒厂串香的香醅中添加产酯酵母，使理化指标提升明显，感官上也更加香浓，纯正，杂味较少。

2.3 真菌在酱香型白酒制酒中的应用

酱香型白酒又称为茅香型白酒，其质量风格以微黄透明、酱香突出、优雅细腻、酒体醇厚、空杯留香持久而著称，有低而不淡、香而不艳之口感[19]。

2.3.1 霉菌

目前从酱香型大曲中分离得到的霉菌主要有毛霉、根霉、犁头霉、曲霉、青霉、红曲霉等，充分体现了酱香酒酿造中霉菌的群落结构及多样性[43]。在霉菌中，根霉和红曲霉能够产较高的α-淀粉酶与酸性蛋白酶，这两种酶能在酿酒的高温及酸性环境下发挥作用，还能产生活性较高的糖化酶[44-45]。周靖[46]从酱香型大曲中分离出1 株红曲霉，其具有较高的酯化酶活，能够促进白酒生产中的酯类物质的生产。另外霉菌的协同作用对白酒的风味物质还有一定的影响，霉菌在酱香型白酒发酵过程中能生成醇、醛、酮、酯等呈香物质，这些物质是形成酱香酒独特风味物质的前体物质。邓皖玉等[47]从高温大曲中分离得到几株霉菌，通过一系列检测，确定该菌株可产具有硫香的酱味。霉菌与微生物之间的相互作用对酱香白酒发酵也有不可忽视的影响。许士池等[48]将霉菌与白曲霉按适当比例混合，对其进行混合酿酒实验，发现混菌发酵对总酸、总酯的含量有着重要影响。其实霉菌具有极大的潜力，但目前人们对霉菌的研究基本还停留在多样性上，其在酿酒中的功能性认识还较少，多数霉菌都被认为无作用或作用较小甚至被认为是有害的，因此区分霉菌在酿造过程中的利弊，根据好坏来研究酿酒中霉菌应是今后的切入点。

2.3.2 酵母

酱香型白酒酵母菌主要有扣囊复膜酵母、异常毕赤酵母、东方伊萨酵母、毕赤酵母等，他们分布于堆积糟、酒醅等各个工序。每个酒企有着自己独特的酵母种群，在发酵过程中最终得到的原酒也有自身独特的风格。

随着人们对功能菌研究的不断深入，发掘出自身酒企中耐高温、高酸、高产酒精的酵母菌已刻不容缓。李红[49]、马荣山[50]、徐超英[51]、任道群[52]、庄名扬等[53]分别在贵州茅台集团、四川郎酒等酱香型白酒企业的堆积糟、酒醅中筛选分离出能够耐高温、强耐酒精，高产乙醇，酶活力高、发酵力强的理想酵母菌。分离筛选后，采用优良菌种培养出来的酒曲在生产中能够很大程度地改善原酒酒质和出酒率。

酱香型白酒中由于制曲时温度较高，导致大部分酵母菌死亡，而在堆积过程，能够从外界再次网罗酵母菌，使酵母数量大幅度增加。微生物具有糖化和生香作用，但是酱香大曲中生香是主要的，在发酵过程中细菌与酵母等微生物共同作用下才产生了独特的酱香风味[54]。通过研究发现，将功能酵母混合加入窖池，能够提高白酒中酯类物质的含量，增加酱香白酒的风味，且不影响出酒率[55]。

2.4 真菌在丢糟中的应用

白酒的生产虽然会将蒸馏完的糟醅重新投放到窖池中，一方面是糟醅能够起到疏松的作用，使酒醅能够更好地发酵；另一方面是糟醅中残余淀粉较多，重新进入发酵可有效地利用这些残余淀粉，因此有着“千年窖泥万年糟”的说法。但是一轮一轮的蒸酒，还是不可避免地要丢弃一部分糟醅，即丢糟。丢糟中的残余淀粉含量仍然较高，在堆放过程中由于水分较大，因此极不易储存[56]，大量的中小型白酒企业的丢糟是直接转卖用作饲料，但是其蛋白质含量较低，牲畜适口性不佳，价格也极其便宜，因此如何将丢糟资源化是人们亟需解决的问题。

在丢糟回收利用的问题上，真菌在此应用上也有一席之位。扣囊复膜酵母酵母具有较高的产淀粉酶能力，对丢糟的利用有帮助，能够节约原料。庄名扬等[57]将丢糟集中至专门的窖池中，通过添加耐温耐酸的酵母菌，使出酒率显著提升，且酒体风味纯正，无异杂味。

霉菌中的木霉含有多种酶系，尤其是纤维素酶，是生产纤维素酶的重要菌种，它能够利用农副产品，如麦秆、木材、木屑等纤维素原料使之转变为糖质原料。在白酒生产的丢糟中，仍含有较多的淀粉和纤维素，通过加入木霉纤维素酶将丢糟再次发酵，可进一步提取酒精。研究发现所有复合菌均可使丢糟酸度及纤维素含量下降，同时能有效增加丢糟蛋白质含量[58]。另外木霉生产的纤维素酶加入糖化酶和TH-AADY，可使丢糟出酒率达3.5 %[59]，木霉中的纤维素酶合理地利用也可具有显著的经济和环境效益[60]。

3 真菌的纯种培养工艺流程

在酿酒中应用的真菌主要是霉菌跟酵母菌，通过系统的筛选分离鉴定，可得到纯种的优良菌株。霉菌跟酵母的培养过程存在差异，一般霉菌可全程采用固体培养，而酵母则需在扩大培养过程中采用液态培养，最终大规模生产时两者基本差不多，都可接种后采用通风制曲进行生产。

3.1 原料

纯种培养采用的原料一般为麸皮，主要是因为麸皮的松散性和其拥有足够菌种生长繁殖的营养物质，如淀粉、蛋白质以及各种微量无机盐，另外在霉菌和酵母培养方面，可适当的添加玉米、早籼米，使微生物能够更好地生长繁殖。

3.2 初级培养

3.2.1 试管培养

菌种的纯种培养首先就是试管培养，试管培养过程必须保证菌种不受污染，保证试管培养的质量，才能让后面的扩大培养不受影响，否则将严重影响酒质、出酒率。试管培养的基本步骤是将制备好的培养基用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌处理，一般为121 ℃，30 min。灭菌结束后倾斜放置，冷却后即可接种，然后放入30 ℃恒温培养箱培养3～5 d，最后进行检测鉴定，确认质量合格后即可置于4～8℃冰箱中进行保藏（不宜超过3 个月），准备三角瓶扩大培养。

3.2.2 三角瓶培养

霉菌流程：麸皮、水润料→装瓶→灭菌→冷却→试管菌种的接种→恒温培养→扣瓶→出瓶→干燥→粉碎保藏。

称取麸皮倒入容器中，加水70%～80%，充分拌匀。用大口径漏斗将其装入灭菌干燥冷却后的500 mL 三角瓶中，每瓶装料40～50 g，密封包扎后灭菌30 min[12]。灭菌结束后趁热将麸皮摇散，冷却至30～35 ℃后在无菌环境中进行接种，接种完充分摇匀。再将其置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，待菌丝密布、麸皮结块时进行扣瓶，即将瓶子轻轻倒扣，以增加底部菌种与空气的接触面积，促进菌种生长繁殖，继续培养1 d。再将三角瓶置于35～40 ℃培养箱中进行干燥，使菌种停止生长，利于保存。最后在无菌环境中将麸皮研磨粉碎，装入无菌干燥的纸袋于无菌干燥器中保存。

酵母流程：溶液糖度为11～12°Bx 培养液→装瓶→灭菌→冷却→试管菌种的接种→恒温培养→保藏

取适量麦芽浸粉，加水溶解，控制溶液糖度至11～12 °Bx，分装入500 mL 三角瓶中，每瓶加入250 mL。密封后灭菌30 min，待冷却后接种试管菌种，置于30℃恒温摇床中，140 r/min，培养20～36 h。准备进一步的扩大培养。

3.3 真菌扩大培养

3.3.1 霉菌的浅盘曲种的培养

流程：麸皮、水润料→灭菌→冷却→三角瓶种子接种→装盘→培养→烘干→浅盘种曲

浅盘曲种培养的物料配比与三角瓶培养相同，麸皮加水充分拌匀后即可灭菌，无菌室中冷却至30 ℃左右接入三角瓶菌种0.3 %，拌匀后进行装盘，放入保温室中28～30 ℃培养。18 h 左右后品温达到35～37 ℃，将曲盘摆成“X”或“品”字状使品温稍下降。24 h 后菌丝饱满，麸皮结块，即可扣盘，继续培养至品温30 ℃左右时进行无菌烘干处理。温度设施为35～40 ℃，待将水分渐渐减少后，再将温度升至40～45 ℃。最后无菌条件下将麸皮粉碎保藏。

3.3.2 酵母的种子罐培养

流程：营养液配制→入种子罐→灭菌→冷却→三角瓶接种→培养→放罐→进一步扩大培养

营养液的培养基与之前的配料相同，不过在加入种子罐之前需要添加消泡剂，防止培养过程中产生大量的泡沫，影响生产。入种子罐后按照灭菌流程设定灭菌温度为121 ℃，保压30 min 灭菌。待冷却至30 ℃后可进行三角瓶接种，接种结束后设置种子罐培养温度为30 ℃，并设置低转速，pH 值控制在4.5～6.0，待酵母生长趋于停止时可结束培养，进入下一阶段。

3.4 菌种的生产

一般酒企采用通风制曲进行大规模的菌种生产，它有着节省劳动力和厂房面积的优点。霉菌与酵母在此阶段除接种方式不同之外，其他操作基本相同。

工艺流程：麸皮、水→拌料→蒸料→扬冷→浅盘接种→入池→通风培养→烘干→保藏

将粉碎后的麸皮与水按之前的配比拌匀后在蒸锅中蒸料，蒸锅设定灭菌压力为1.2～1.3 Bar，时间为1.3～2.0 h。蒸料结束后将物料倒出进行扬冷或摊晾，待冷却至35 ℃左右时可加入浅盘曲种进行接种，接种量为0.3%～0.5%。充分拌匀后迅速装入通风培养池内，厚度25～30 cm，静置培养至品温为36 ℃左右时可进行间断性的通风降温。待培养约15 h 后，霉菌由于呼吸作用会导致品温急剧上升，此时应持续通风，使品温保持在35 ℃左右。24 h 左右菌丝密布时，养分已大量消耗，此后菌丝生长缓慢，此时可进行干燥，操作原理同浅盘制曲。待干燥结束后即可入库保藏。

4 总结与展望

真菌在白酒生产中的应用方面，主要包括优良菌种的筛选分离、制作功能强化曲、酯化液与生香酵母混合、制作粗酶制剂等。对在高温、高酸等恶劣环境下仍能产生较高的活化酶的优良菌种进行筛选分离、纯化培养等手段制成功能曲，将功能曲添加至白酒生产中，提高白酒中酯类的含量，使酯类物质比例适当，增加风味物质或风味前体物质来增加名优白酒的产量。由于白酒行业对传统工艺要求较高，对微生物的新技术领域探索仍有许多不足之处。例如现在筛选优良菌种操作繁琐、难度较大，多个地区也仅能筛选出屈指可数的优良菌株，且一些菌株区域性强，效果不明显、不稳定，易受环境影响等。随着科学的不断进步，基因工程、DNA提取技术等快速发展，人们对真菌研究也将不断深入，真菌的一系列的潜力将被人们挖掘出来，白酒的质量和产量也将有着质的飞跃。