顾晓颖，金 娜，付晓萍，李凌飞

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，昆明 650201; 2.昆明理工大学 津桥学院,昆明 650106)

花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)，即顺-5, 8, 11, 14-二十碳四烯酸，属于n-6系列多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，其具有多种药理功能和营养功效[1-2]。高山被孢霉(Mortierellaalpina)属于接合菌纲毛霉目被孢霉科被孢霉属，是一种产油丝状真菌，目前已作为商业菌株工业化生产ARA[3]，且在美国、日本、英国和加拿大已有ARA的发酵商品投放市场。

优化M.alpina发酵条件是提高ARA产量最直接有效的方法，亦是当前的研究热点。影响M.alpina中ARA产量的发酵因素有碳源、氮源、溶氧量、pH、温度等，其中碳、氮源的种类及浓度对M.alpina的生长及脂肪酸的积累具有较大影响。M.alpina可利用的氮源有无机氮源和有机氮源，不同种类的氮源能影响代谢产物合成的方向和产量[4-6]。在碳过量而氮缺乏条件下，M.alpina代谢平衡被打破，菌株不再继续生长而是进入脂质积累期，将过量的碳源以甘油三酯的形式储存于细胞内[7]。

ARA属于M.alpina的胞内油，其产量不仅受菌体内脂肪酸含量的影响，同时受菌体生物量的影响。在氮限制条件下，菌体内脂肪酸含量的升高有利于ARA产量的提高，同时氮限制对菌体生长的抑制又会造成ARA产量的降低。目前，关于碳氮比(C/N)如何影响M.alpina中ARA积累的研究甚少。本研究分别以无机氮硝酸钠和有机氮尿素为氮源，在不同C/N条件下进行M.alpina发酵实验，测定发酵过程中菌体生物量(DCW)、发酵液残C量和残N量、菌体中各脂肪酸组分含量随时间的动态变化，明确C/N对M.alpina中ARA积累的影响，以期获得M.alpina高产ARA的最优氮源种类及C/N，为M.alpina工业化生产ARA提供理论依据和实际指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

高山被孢霉(M.alpinaD36)，由本实验室从土壤中分离获得，并通过形态学结合分子生物学技术进行了鉴定。

1.1.2 试剂

葡萄糖，酵母浸粉，尿素，硝酸钠，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，甲苯，浓硫酸，甲醇，正己烷，氯化钠，碳酸氢钾，3, 5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，氢氧化钠，对二甲氨基苯甲醛，标准品十七烷酸(Sigma公司)等。

1.1.3 仪器

安捷伦5975C-7890A气相色谱-质谱联用仪，DN-12A干式氮吹仪，LGJ-12冷冻干燥机，TS-211CF往复回旋式摇床，752S紫外分光光度计，YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1C双人单面净化工作台，-80℃低温冰箱。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制

种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母浸粉6 g/L，KH2PO43 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

以尿素为氮源，低C/N培养基(C/N 10∶1)配方为葡萄糖 47.86 g/L、尿素4.29 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；中C/N培养基(C/N 20∶1)配方为葡萄糖48.93 g/L、尿素2.14 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；高C/N培养基(C/N 40∶1)配方为葡萄糖49.46 g/L、尿素1.07 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

以硝酸钠为氮源，低C/N培养基(C/N 10∶1)配方为葡萄糖50 g/L、NaNO312.15 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；中C/N培养基(C/N 20∶1)配方为葡萄糖50 g/L、NaNO36.07 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；高C/N培养基(C/N 40∶1)配方为葡萄糖50 g/L、NaNO33.03 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

各培养基中初始C质量浓度均为20 g/L；高、中、低C/N条件下培养基中初始N质量浓度分别为0.5、1.0、2.0 g/L。

种子培养基装液量为50 mL/250 mL，发酵培养基装液量为100 mL/500 mL，115℃灭菌15 min。

1.2.2M.alpina发酵实验

无菌挑取少量保藏于PDA斜面培养基上的M.alpina菌丝体，转接于种子培养基中，在前期研究筛选出的最优发酵温度(20℃)和转速(175 r/min)[8]下培养3 d。而后挑取10～15个1～2 mm的种子菌球分别转接于不同C/N的培养基中，20℃、175 r/min下培养，分别于3、6、9、12 d取样进行检测分析。

1.2.3 发酵液中残C量和残N量的测定

发酵液中葡萄糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸法[9]，尿素含量的测定采用对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法[10]，硝酸钠含量的测定参照GB 11894—1989《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》。

以硝酸钠为氮源，发酵液中残C量=发酵液中葡萄糖含量×葡萄糖中碳元素质量分数；发酵液中残N量=发酵液中硝酸钠含量×硝酸钠中氮元素质量分数。C消耗量=培养基中初始C含量-残C量。

以尿素为氮源，发酵液中残C量=发酵液中葡萄糖含量×葡萄糖中碳元素质量分数+发酵液中尿素含量×尿素中碳元素质量分数，发酵液中残N量=发酵液中尿素含量×尿素中氮元素质量分数，N消耗量=培养基中初始N含量-残N量。

1.2.4 菌体生物量(DCW)的测定。

采用干重法测定。发酵完成后，真空抽滤分离发酵液和菌体，蒸馏水洗涤菌体3次。收获的菌体至-20℃预冻24 h后真空冷冻3 d，称重。菌体生物量以每升发酵液中干菌体的质量表示。

1.2.5 脂肪酸组成的测定

参照文献[8, 11]，向50 mg冻干的菌丝粉中加入1 mL甲苯、2 mL 1%硫酸甲醇溶液和1 mL质量浓度为1 mg/mL的十七烷酸作为内标，于50℃过夜，然后采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对形成的脂肪酸甲酯进行定性和定量分析。GC-MS的参数设置参照Gu等[8]的方法。菌体中各脂肪酸含量，以每克冻干菌丝粉中所含脂肪酸的毫克数表示。菌体总脂肪酸(TFA)含量为菌体中各脂肪酸含量之和，以ARA含量与TFA含量的比例计算ARA比例，以菌体中ARA含量与菌体生物量乘积计算ARA产量。

1.2.6 统计分析

利用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。对各组数据进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，各组之间均值的两两比较采用Duncan多重比较法。对不同C/N条件下C消耗量、N消耗量、DCW、TFA含量、ARA产量进行Pearson相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 以硝酸钠为氮源，不同C/N条件下的发酵实验

2.1.1 不同C/N对菌体生长的影响(见图1)

由图1可见：以硝酸钠为氮源，高C/N条件下真菌生长最快；发酵时间相同时(除3 d)，高C/N条件下DCW显著高于中、低C/N条件；高C/N条件下发酵12 d，DCW最高，为6.42 g/L，是低C/N条件下的2.3倍。可见，低浓度硝酸钠(即高C/N条件)有利于菌体生长，原因可能是低浓度硝酸钠有利于菌体对C、N的消耗吸收。

注：图中字母相同表示无统计学差异(P>0.05)，反之有统计学意义(P<0.05)。下同。

2.1.2 不同C/N对C消耗量的影响(见图2)

图2 硝酸钠为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间发酵液残C量

由图2可见：以硝酸钠为氮源，发酵液初始C含量相同(20 g/L)，但高C/N培养基中残C量较低，表明高C/N有利于M.alpina消耗发酵液中的C；相同发酵时间下，高C/N培养基中C消耗量最大，其次是中C/N；发酵结束时，高、中、低C/N条件下发酵液中残C量分别为10.68、13.81、16.05 g/L，即C消耗量分别为9.32、6.19、3.95 g/L。高C/N条件下的C消耗量是低C/N条件下C消耗量的2.36倍，是中C/N条件下的1.51倍。

2.1.3 不同C/N对N消耗量的影响(见图3)

由图3可见，以硝酸钠为氮源，M.alpina的N消耗量与发酵液中的初始N浓度相关。随着发酵时间的延长，高C/N条件下发酵液残N量下降明显，表明高C/N条件下真菌对N的消耗更快。发酵结束时，各个浓度下发酵液中的N均未耗尽，高、中、低C/N条件下发酵液中残N量分别为0.21、0.83、1.88 g/L，即N消耗量分别为0.29、0.17、0.12 g/L。高C/N条件下N消耗量是低C/N条件下的2.4倍。

图3 硝酸钠为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间发酵液残N量

2.1.4 不同C/N对菌体中TFA含量和ARA比例的影响(见图4、图5)

图4 硝酸钠为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间菌体中的TFA含量

图5 硝酸钠为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间TFA中ARA的比例

由图4可见，以硝酸钠为氮源，M.alpina干菌体中TFA含量的变化无明显规律性。发酵3 d和12 d时，高、中C/N条件下菌体中TFA含量显著高于低C/N条件下的；而发酵6 d和12 d时，高、中、低C/N 条件下的TFA含量没有统计学差异。

由图5可见，以硝酸钠为氮源，TFA中ARA比例在19.13%～33.77%之间。发酵9 d和12 d时，高、中、低C/N条件下 ARA比例均无统计学差异。中C/N条件下，ARA比例随发酵时间延长呈现先升高而后降低的趋势，发酵6 d时ARA比例最高，为33.77%。高、低C/N条件下ARA的比例随发酵时间的延长没有统计学差异。

2.1.5 不同C/N对ARA产量的影响(见图6)

图6 硝酸钠为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间ARA的产量

由图6可见:以硝酸钠为氮源，C/N对ARA产量的影响与对DCW的影响一致；ARA产量随发酵时间的延长逐渐升高，相同发酵时间下ARA产量的趋势为高C/N>中C/N>低C/N。发酵12 d，高C/N条件下ARA产量为0.21 g/L，是中C/N条件下的1.75倍，是低C/N条件下的4.67倍。以硝酸钠为氮源，高C/N有利于M.alpina发酵生产ARA，主要是由于高C/N条件下所获DCW更高。

2.1.6 不同C/N条件下各变量之间的Pearson相关系数(见表1)

表1 以硝酸钠为氮源时不同C/N条件下各变量之间的Pearson相关系数

续表1

由表1可见：高、中、低C/N条件下DCW与C消耗量和N消耗量呈显著正相关，并且，中、低C/N条件下C消耗量与N消耗量也呈显著正相关；TFA含量与DCW、C消耗量、N消耗量无显著相关性；高、中、低C/N条件下，ARA产量与DCW呈显著正相关，Pearson相关系数分别为0.688、0.508和0.603。

综上，以硝酸钠为氮源，虽然高、中C/N条件下菌体中TFA含量和ARA比例整体没有显著差异，但由于高C/N条件下DCW最高，故ARA产量也最高。其原因可能是在较差的无机氮条件下，M.alpina的C消耗量较低，摄入的有限C仅能满足M.alpina的生存需求，由于M.alpina生长状态较差，胞内代谢物积累量也较低。

2.2 以尿素为氮源，不同C/N条件下的发酵实验

2.2.1 不同C/N对菌体生长的影响(见图7)

图7 尿素为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间的菌体生物量

由图7可见：随着发酵时间的延长，同一发酵时间不同C/N条件下DCW差异逐渐增大；发酵3 d和6 d时，各C/N条件下DCW差异不大；发酵12 d时，低C/N条件下DCW显著高于中、高C/N条件下，为18.2 g/L。结合图1可见，以尿素为氮源，DCW明显高于以硝酸钠为氮源。

2.2.2 不同C/N对C消耗量的影响(见图8)

由图8可见：发酵12 d，发酵液中的C均未耗尽，高C/N条件下发酵液中残C量为9.55 g/L(发酵液中初始C含量相同，均为20 g/L)，即C消耗量为10.45 g/L，C消耗率为52.3%；中C/N条件下残C量为4.53 g/L，即C消耗量为15.47 g/L，C消耗率为77.4%；低C/N条件下残C量为4.39 g/L，即C消耗量为15.61 g/L，C消耗率为78.1%。发酵后期(9 d和12 d)，中、低C/N条件下C的消耗量显著高于高C/N条件。

图8 尿素为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间发酵液残C量

2.2.3 不同C/N对N消耗量的影响(见图9)

图9 尿素为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间发酵液残N量

由图9可见，不同C/N条件下发酵液中残N量随发酵时间的延长急剧下降。高C/N条件下，发酵液中的N在9 d时消耗殆尽；中C/N条件下发酵9 d时，发酵液中残N量仅为0.1 g/L，发酵结束(12 d)时N消耗率为92.5%；低C/N条件发酵12 d时，残N量为0.65 g/L，N消耗率仅为67.5%。

2.2.4 不同C/N对菌体中TFA含量和ARA比例的影响(见图10、图11)

由图10可见，以尿素为氮源，随发酵时间的延长，菌体中TFA含量不断增加。同一发酵时间，高、中C/N条件下菌体中TFA含量明显高于低C/N条件；发酵结束时高C/N条件下菌体中TFA含量达305 mg/g(干基)。故高、中C/N条件有利于M.alpina积累TFA。

图10 尿素为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间菌体中的TFA含量

由图11可见，以尿素为氮源，TFA中ARA比例在20.67%～34.32%之间。随发酵时间的延长，高、中、低C/N条件下菌体中ARA比例呈现相同的变化趋势，即发酵3 d时ARA含量最低，从6 d起ARA含量无统计学差异。在各发酵时间点，高、中、低C/N条件下 ARA比例也无统计学差异。表明以尿素为氮源，不同C/N条件对菌体中ARA的比例几乎无影响。

2.2.5 不同C/N对ARA产量的影响(见图12)

图12 尿素为氮源，不同C/N条件下不同发酵时间的ARA产量

由图12可见，以尿素为氮源，中C/N条件有利于M.alpina生产ARA。发酵3 d和6 d时，高、中、低C/N条件下ARA产量没有统计学差异。发酵12 d时，中C/N条件下ARA产量为0.99 g/L，显著高于高、低C/N条件。对比图6可以看出，以尿素为氮源，ARA产量明显高于以硝酸钠为氮源。

2.2.6 不同C/N条件下各变量之间的Pearson相关系数(见表2)

表2 以尿素为氮源时不同C/N条件下各变量之间的Pearson相关系数

由表2可见，以尿素为氮源，高、中、低C/N条件下DCW与C消耗量、N消耗量均呈显著正相关，该结果与以硝酸钠为氮源时一致。与硝酸钠不同的是，以尿素为氮源，中、低C/N条件下TFA含量与C消耗量也呈正相关，表明消耗的C一部分满足菌体生长，另一部分则通过正常代谢积累TFA。在尿素为氮源、高C/N条件下，TFA含量与DCW无明显相关性，而与C消耗量呈显著正相关，表明当菌株处于N饥饿条件下，菌体生长缓慢甚至不生长，发酵液中消耗的C大量流向TFA积累途径[12]。

总之，以尿素为氮源，中C/N条件有利于提高M.alpina的ARA产量。虽然随着发酵时间的延长，低C/N条件下M.alpina的生长优势逐渐凸显(DCW最高)，但其菌体中TFA含量较低，ARA比例也较低，导致ARA产量较低；虽然中、高C/N条件下菌体中TFA含量及ARA比例没有显著差异，但随着发酵时间的延长，9 d时高C/N条件下发酵液中的N被耗尽，抑制了菌体生长，最终导致ARA产量不高。

3 结 论

本研究基于不同氮源及不同C/N条件下M.alpina的生长状况和脂肪酸积累分析，明确了C/N对M.alpina中ARA产量的影响效应。以无机氮硝酸钠为氮源，高C/N条件有利于M.alpina发酵生产ARA，但生物量和ARA产量远低于以有机氮尿素为氮源的；以尿素为氮源，低C/N条件下获得了较高的DCW，但低C/N条件下菌体中TFA含量和ARA比例较低，故ARA产量不高。本研究表明有机氮更有利于M.alpina菌体生长和ARA的积累，以尿素为氮源，在中C/N条件下可获得较高的ARA产量。