APP下载

miR-203a-3p抗弥漫性大B细胞淋巴瘤的作用及机制研究

2020-12-15刘安生

福建医科大学学报 2020年5期
关键词:荧光素酶孵育质粒

赵 婷, 刘安生, 王 华

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是一种非霍奇金淋巴瘤,也是一种具有高度侵袭性的淋巴系统弥漫性恶性增生性疾病,存在生发中心B细胞样和活化B细胞样两个主要分子亚型[1-4]。现阶段治疗DLBCL多采用利妥昔单抗联合化疗,虽然可以有效治疗大多数患者,但仍有约1/3的患者存在难治愈和复发的情况[5-6]。因此,有必要进一步了解DLBCL发生的分子机制,确定新分子靶点和治疗策略,提高DLBCL患者的预后率。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一组长度为18~23个核苷酸的非编码RNA[7]。越来越多的研究发现,miRNA作为肿瘤的抑制剂或者癌基因参与人类多种不同类型的疾病[8]。有研究报道,miRNA可通过与mRNA 3′-UTR碱基互补配对来调节基因的表达,因此miRNA的失调与肿瘤的发生、转移和预后密切相关[9-10]。miR-203a-3p在很多肿瘤中已被研究,如在鼻咽癌中,通过抑制LASP1蛋白的表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和代谢[11],在胃癌中下调胰岛素样生长受体-1(insulin like growth factors receptor 1, IGF-1R)抑制肿瘤的增殖[12]。然而,在DLBCL细胞中,miR-203a-3p的生物学作用和机制尚不清楚。FOXP1是FOXP家族成员之一[8],参与机体的多种生理过程,且过表达于多种肿瘤组织中,与肿瘤的发生发展密切相关[13-15]。本研究拟检测miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL组织中的表达水平,同时探究二者对DLBCL细胞增殖和侵袭的作用,揭示miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL发生发展中的作用机制,为DLBCL患者的预后提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织 收集30例DLBCL组织,均经病理证实(根据2008年世界卫生组织的分类),患者均未接受过相关治疗。另取20例淋巴结反应性增生(reactive hyperplasia of lymphnode, RH)组织作为对照。本研究经医院伦理委员会批准,患者均知情同意。

1.1.2细胞 人DLBCL细胞株SU-DHL-4和HBL-1(编号:BNCC 340176和BNCC 341660,上海中国科学院细胞库),用含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液培养细胞,培养温度为37 ℃,二氧化碳的体积分数为5%。

1.1.3试剂 RPMI 1640培养液(批号:R8758,美国Sigma公司);胎牛血清(南美特级,批号:40130ES76,美国Hyclone公司);miR-203a-3p模拟物(miR-203a-3p mimic)及其相应的对照物(NC-mimic)(广州日博生物有限公司);FOXP1小干扰RNA(si-FOXP1)及其对照物(Scramble)(美国Santa公司);荧光素酶报告基因质粒(美国Promega公司);FOXP1过表达质粒(pcDNA-FOXP1)(美国Addgene公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(批号:C0029,碧云天生物技术有限公司);Wnt1(货号:ab105740)、β-catenin(货号:ab6302)、Cyclin D1(货号:ab134175)及c-Myc(货号:ab32072)(艾博抗生物科技有限公司);山羊抗兔二抗(货号:31402,美国赛默飞科技公司)。

1.1.4仪器 Esco CelSafe CO2培养箱(艺思高生物科技有限公司);奥林巴斯倒置显微镜(CKX53,明美光电技术有限公司);SpectraMax iD5多功能微孔板读板(Molecular Devices公司);流式细胞仪(FACS Calibur,美国BD公司);实时荧光定量PCR仪(美国ABI StepOne公司);SDS-PAGE凝胶电泳仪(JX196552JY-JX5,邢台润联科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞转染 将SU-DHL-4和HBL-1细胞接种到24孔板中,待细胞密度达70%时进行转染。3 μL的Lipofectamine RNAiMAX试剂和1 μL miRNA或siRNA分别稀释到50 μL无血清的培养液中,混合5 min后,将稀释好的Lipofectamine RNAiMAX试剂加入稀释好的miRNA或siRNA中孵育10 min,再加入培养板中孵育24 h。将2.5 μg的pcDNA-FOXP1与空载质粒(Vector)分别与5 μL Lipofectamine RNAiMAX共同混合在125 μL的无血清培养液中,与细胞共孵育。

1.2.2RNA提取和实时定量PCR 组织和细胞总RNA的提取使用TRIzol试剂,按照说明书的要求操作。检测miRNA采用实时定量聚合酶链反应,使用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒,反转录条件:16 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。U6为miRNA的内参标准。mRNA检测采用M-MLV逆转录酶,cDNA扩增采用PrimeScript RT Master Mix,反转录条件:95 ℃ 10 min,40个循环,95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s。GAPDH作为内参基因,采用2-ΔΔCt方法计算miR-203a-3p和FOXP1的表达。引物如下:

miR-203a-3p:

正向:5′-GGCGGGCTGAAATGTTTAGGA-3′

反向:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′

FOXP1:

正向:5′-TCAGTGGTAAC CCTTCCCTTA-3′

反向:5′-GTACAGGATGCACGGCTTG-3′

1.2.3细胞增殖 采用CCK-8试剂评估细胞增殖。收集对数期的细胞接种在96孔板中,并调整细胞密度为每孔3×104个,培养24 h后进行转染,继续培养24,48和72 h。培养结束后每孔加入10 μL CCK-8,37 ℃孵化2 h后,用微型平板分析仪测定光密度值(OD值)。

1.2.4细胞侵袭 细胞以每孔3×104个接种到24孔板小室,下层添加含10%胎牛血清的培养基。孵育24 h后,仔细去除未迁移的细胞,用体积分数为4%的多聚甲醛固定后,用体积分数为0.1%的结晶紫染色15 min。在显微镜下计算5个视野的细胞侵袭数并计算平均值。

1.2.5细胞凋亡 将细胞消化处理后收集到对应的EP管中,用磷酸盐缓冲液清洗3次,将5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在黑暗中加入装有样品的EP管中,室温下孵育20 min,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6荧光素酶报告基因分析 使用microrna.org数据库预测miR-203a-3p和FOXP1之间的靶向关系。构建野生型FOXP1质粒(WT-FOXP1)和突变型FOXP1质粒(Mut-FOXP1)荧光素酶报告载体,采用脂质体3 000分别将WT-FOXP1和Mut-FOXP1与miR-203a-3p mimic和NC-mimic共转染,24 h后使用双荧光素酶测定系统测定荧光素酶活性。

1.2.7免疫印迹 收集细胞并用RIPA裂解液提取总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。上样后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜,用5%脱脂牛奶封闭1 h,洗膜后一抗孵育4 ℃过夜,加二抗室温孵育2 h,ECL试剂检测蛋白。

2 结 果

2.1miR-203a-3p在DLBCL组织中的表达水平 与RH组织比较,DLBCL组织中miR-203a-3p的表达水平显著降低(P<0.01,图1A)。在SU-DHL-4和HBL-1细胞中,与转染NC-mimic比较,转染miR-203a-3p mimic可显著增加两种细胞株中miR-203a-3p的表达水平,差别均具有统计学意义(P<0.01,图1B)。

2.2过表达miR-203a-3p对DLBCL细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响 与NC-mimic组比较,过表达miR-203a-3p能够明显抑制SU-DHL-4和HBL-1细胞的增殖(P<0.01,图2A和2B);Transwell实验结果显示,两种细胞株的相对侵袭细胞数在转染miR-203a-3p mimic后明显降低(P<0.01,图2C)。而凋亡实验结果显示,过表达miR-203a-3p可显著诱导细胞凋亡(P<0.01,图2D和2E)。

nRH=20; nDLBCL=30. A:qPCR检测miR-203a-3p 在RH和DLBCL组织中的表达;B:转染miR-203a-3p mimic后,qPCR检测转染效率. 与NC-mimic组比较,△△:P<0.01.图1 miR-203a-3p在DLBCL组织中的表达水平Fig 1 The expression of miR-203a-3p in DLBCL tissues

2.3FOXP1与miR-203a-3p的关系研究 采用microrna.org数据库预测到在FOXP1的3′-UTR区域存在与miR-203a-3p的结合位点(图3A)。荧光素酶报告基因结果显示,WT-FOXP1质粒和miR-203a-3p mimic共转染后的荧光强度显著低于WT-FOXP1质粒和NC-mimic共转染组(P<0.01,图3B),而Mut-FOXP1质粒和miR-203a-3p mimic共转染后的荧光强度与Mut-FOXP1质粒和NC-mimic共转染后无明显区别。DLBCL患者组织中FOXP1的表达水平显著高于RH组(P<0.01,图3C和3D),SU-DHL-4和HBL-1细胞转染miR-203a-3p mimic后,显著抑制FOXP1的表达(P<0.01,图3E)。

2.4下调FOXP1的表达对DLBCL细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响 在SU-DHL-4和HBL-1细胞中转染FOXP1小干扰RNA,FOXP1的mRNA和蛋白水平均显著下调(P<0.01,图4A)。下调FOXP1后,细胞增殖能力明显被抑制(P<0.01,图4B和4C),细胞侵袭能力也显著下降(P<0.01,图4D),而细胞凋亡则明显增加(P<0.01,图4E和4F)。

nRH=20, nDLBCL=30. A:生物信息学网站预测miR-203a-3p与FOXP1的靶向位点及FOXP1的突变位点;B:荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶的活性;C,D:qPCR检测RH和DLBCL患者组织中FOXP1的mRNA表达及Western-blot检测组织中FOXP1的蛋白表达量;E:转染miR-203a-3p mimic后FOXP1的表达量. 与NC-mimic和FOXP1-WT组比较,△△:P<0.01;与NC-mimic组比较,##:P<0.01.图3 FOXP1与miR-203a-3p的关系Fig 3 Relationship between FOXP1 and miR-203a-3p

A:qPCR检测转染效率,Western-blot检测FOXP1蛋白表达量;B,C:CCK-8实验检测转染后SU-DHL-4 和HBL-1细胞的增殖能力;D:Transwell实验检测转染后细胞的侵袭能力;E:F图对应的统计分析结果;F:流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况. 与Scramble组比较,△△:P<0.01.图4 下调FOXP1的表达对DLBCL细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响Fig 4 Effects of FOXP1 silence on proliferation, invasion and apoptosis of DLBCL cells

2.5过表达FOXP1和miR-203a-3p对DLBCL细胞的增殖和侵袭的影响 单独过表达FOXP1时,FOXP1的mRNA和蛋白水平均高于Vector组(P<0.01),而同时过表达miR-203a-3p和FOXP1时,可逆转单独过表达FOXP1对FOXP1水平的增加作用(P<0.01,图5A和5B)。细胞增殖实验和Transwell实验显示,当细胞转染pcDNA-FOXP1或共转染pcDNA-FOXP1和NC-mimic时,细胞的增殖和侵袭能力均增加,而共转染pcDNA-FOXP1与miR-203a-3p mimic时,FOXP1对细胞增殖和侵袭的促进作用得到逆转(P<0.01,图5B~5F)。凋亡实验结果显示,与Vector组比较,过表达FOXP1可显著抑制细胞凋亡(P<0.05,图5G和5H);而共转染pcDNA-FOXP1与miR-203a-3p mimic时,逆转过表达FOXP1对细胞凋亡的抑制作用。

2.6miR-203a-3p和FOXP1对Wnt/β-catenin信号通路的影响 免疫蛋白印迹实验结果显示,过表达miR-203a-3p或下调FOXP1时,Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白水平显著降低(P<0.01);共转染miR-203a-3p mimic和si-FOXP1时,可进一步降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达(P<0.01);而过表达FOXP1可显著增加Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白表达水平(P<0.01);当共转染miR-203a-3p mimic和pcDNA-FOXP1时,Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的表达水平得到逆转(P<0.01,图6)。

1:NC mimic+Scramble;2:NC mimic+Vector;3:miR-203a-3p mimic+Scramble;4:NC mimic+ si-FOXP1-1;5:NC mimic+pcDNA-FOXP1;6:miR-203a-3p mimic+si-FOXP1-1;7:miR-203a-3p mimic+pcDNA-FOXP1. A:Western-blot实验检测SU-DHL-4转染后Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平;B:Western-blot实验检测HBL-1转染后Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平;C,D分别是A,B对应的统计分析结果. 与NC-mimic+Scramble组比较,△:P<0.05;与NC-mimic+Vector组比较,#:P<0.05;与miR-203a-3p+Scramble组比较,☆:P<0.05.图6 miR-203a-3p和FOXP1对Wnt/β-catenin信号通路的影响Fig 6 Effects of miR-203a-3p and FOXP1 on Wnt/β-catenin signaling pathway

3 讨 论

研究报道,miRNA在人类癌症发展的过程中扮演着重要的角色,其在肿瘤中的生物学作用和机制也逐渐明确[16]。miRNA通过与靶基因的3′-UTR结合来调控与癌症发生发展相关的基因。miRNA的失调同样参与DLBCL的发展过程,如耐泼尼松的DLBCL耐药细胞中,miR-148b表达下调,可促进肿瘤细胞对泼尼松的抗性[17];下调miR-195的表达,可促进DLBCL的发生和免疫逃逸[3];高表达miR-27a通过抑制MET/PI3K/AKT通路促进DLBCL细胞凋亡,进而抑制DLBCL的发展[18]。

以往研究表明,miR-203a-3p在多种肿瘤组织中表达异常,包括肝癌、骨肉瘤及结直肠癌等,提示miR-203a-3p参与肿瘤的发展[19-21]。本研究以miR-203a-3p在DLBCL进展中的作用为出发点,结果发现,在DLBCL组织中,miR-203a-3p的表达量较RH组织显著降低,提示miR-203a-3p在DLBCL中也存在异常表达的现象。当SU-DHL-4和HBL-1细胞过表达miR-203a-3p时,细胞增殖与侵袭受到抑制,且具有显著性,表明miR-203a-3p在DLBCL中发挥抑癌作用。

FOXP1蛋白是多功能转录因子,从参与器官的发生到调节免疫功能代谢都发挥着重要的作用[22]。研究报道FOXP1在多种肿瘤中表达失调,既有抑癌作用,也有作为癌基因的作用,这取决于细胞环境,如Sheng等报道FOXP1在肺癌的发生发展中通过促进肺癌细胞的凋亡而起到保护作用[23];相反,Wang等报道FOXP1能够促进多发性骨髓瘤的进展[24];另有文献报道FOXP1可增强非小细胞肺癌的致瘤性[25],促进肺癌细胞的增殖与侵袭[26]。本研究发现,DLBCL组织中FOXP1的表达水平显著升高,当下调FOXP1时,可显著抑制DLBCL细胞的增殖与侵袭,促进凋亡,说明FOXP1在DLBCL中扮演着癌基因的作用。

通过生物信息学网站预测到FOXP1是miR-203a-3p的一个靶基因,当细胞过表达miR-203a-3p时,FOXP1的表达受到抑制,说明miR-203a-3p可下调FOXP1的表达,而逆转实验同样也说明miR-203a-3p可调节FOXP1的表达。文献报道FOXP1可通过激活Wnt/β-catenin信号通路来促进肿瘤的发生发展[27],因此本研究也进一步探讨miR-203a-3p对FOXP1的调控是否与Wnt/β-catenin信号通路有关。当过表达miR-203a-3p或者下调FOXP1,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达受到抑制,而当高表达FOXP1时,Wnt/β-catenin信号通路处于激活状态,相关蛋白表达水平显著升高,以上结果均说明miR-203a-3p调控FOXP1表达参与DLBCL的发展是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。

综上所述,miR-203a-3p在体外能够抑制DLBCL细胞的增殖、侵袭,促进凋亡,过表达miR-203a-3p能够抑制FOXP1表达,导致Wnt/β-catenin信号通路的失活。这些结果均提示miR-203a-3p是DLBCL中一个重要的抑癌分子,可能成为DLBCL患者早期诊断或治疗的潜在靶点。

猜你喜欢

荧光素酶孵育质粒
扳机日血清雌激素不同水平时授精前后卵母细胞孵育时间对短时受精胚胎移植结局的影响
农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介
——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展
全基因组测序后质粒的组装与鉴定研究进展*
NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证
mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33∶A-∶B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析
双荧光素酶报告基因系统在家蚕基因启动子研究中的应用
开发新方法追踪植物病害的全球传播(2020.6.7 iPlants)
用课程“孵育”会“发光”的教室
家兔β干扰素启动子质粒的构建及其启动子活性鉴定
军事电子专业研究生创新能力的孵育与拓展