汤兴宇 扈麟 吴中琴 周明玺 钟嫒嫒 王钰雯 廖奕扬 田星 王远亮

摘 要：肉及其副产物中含有多种蛋白质，这些蛋白质经过酶解、微生物发酵或胃肠道消化后，产生多种有益于人体的活性肽，如降血压肽（血管紧张素转化酶抑制肽）、抗氧化肽、抗菌肽和二肽基肽酶抑制肽等。肽的生物活性逐渐被人们重视，但其提取和筛选仍然受到分离鉴定技术的限制。计算机分析技术能够很好地评估及分离鉴定蛋白质作为活性肽前体蛋白的能力，模拟酶及化学作用对蛋白质的水解，预测肽序列的活性及其化学性质。本文对肉源性活性肽进行综述，并介绍计算机分析技术在分离鉴定活性肽中的应用。

关键词：肉源性活性肽;蛋白质;酶解;计算机分析技术

Abstract： Meat and meat processing by-products contain a variety of proteins， which can be used to produce various bioactive peptides that are beneficial to the human body after enzymatic hydrolysis， microbial fermentation or gastrointestinal digestion， such as antihypertensive peptide （angiotensin converting enzyme inhibitory peptide）， antioxidant peptide， antibacterial peptide， and dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitory peptide. Although increasing attention has been paid to the bioactivities of peptides， extraction and screening of peptides are still limited by the existing purification and identification techniques. In silico analysis can characterize the potential of proteins as precursors of bioactive peptides， simulate proteolysis catalyzed by enzymatic or chemical action， and predict the activity of peptide sequences and their chemical properties. In this paper， bioactive peptides derived from meat proteins are reviewed， as well as the application of in silico analytical techniques in the separation and identification of bioactive peptides.

Keywords： bioactive peptide derived from meat; protein; enzymolysis; in silico analysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173

中图分类号：TS201.1                                      文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）09-0088-08

引文格式：

汤兴宇， 扈麟， 吴中琴， 等. 肉源性活性肽及其计算机分析技术研究进展[J]. 肉类研究， 2020， 34（9）： 88-95. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173.    http：//www.rlyj.net.cn

TANG Xingyu， HU Lin， WU Zhongqin， et al. Recent progress in meat-derived bioactive peptides and In silico analytical techniques for them[J]. Meat Research， 2020， 34（9）： 88-95. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173.    http：//www.rlyj.net.cn

肉是人類摄取蛋白质的主要来源之一，新鲜肉中的蛋白质主要包括肌纤维蛋白和肌浆蛋白两大类。刚屠宰后胴体中许多肽酶仍然具有活性，这些肽酶能够促进肌浆蛋白和肌纤维蛋白的水解以及肽的释放，尤其是内肽酶与外肽酶[1]。活性肽在蛋白质水解过程中从前体蛋白中释放，它是一类能调节生理功能的氨基酸序列，能在体内与特定受体结合，发挥生物学活性。已有许多研究证明，肉源性生物活性肽具有良好的功能特性，如降血压、抗氧化和抗菌等。不同来源的肉或肉制品水解的蛋白质和释放的肽也存在差异[2]。Escuder等[3]研究表明，与肌浆蛋白（3 534 个肽序列）相比，肌原纤维蛋白可产生更丰富的生物活性肽（6 330 个肽序列）。通过蛋白质的水解模式和肽的产生可以区分不同种类的肉制品。例如，与萨拉米香肠相比，福特香肠中肌动蛋白水解更为显著，来源于肌动蛋白的肽数量也最多，而萨拉米香肠中产生的肽则主要来源于肌红蛋白、M型肌酸激酶和L-乳酸脱氢酶[4]。

在肉制品工业中，加工后剩余的血液、骨头、皮肤、角、脏器等副产物往往会被制成动物饲料、肥料、食品添加剂和生物燃料等[5]，利用率较低。这些“边角料”中富含蛋白质，并且是活性肽的良好来源。骨头中胶原蛋白占骨蛋白的90%[6];Wang Xueqi等[7]从羊骨中制备钙螯合肽;鱼皮中也含有丰富的胶原蛋白，尹剑等[8]从鲟鱼鱼皮胶原蛋白中制备抗氧化肽，优化酶解工艺后产生的抗氧化肽能显著增加总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S转移酶的活性;Lee等[9]的研究结果证明亚临界水解鱼皮胶原蛋白肽具有降脂效果;血液中富含血红蛋白和纤维蛋白，Yang Jing等[10]从鸭血中分离出7 种抗氧化肽，Adje等[11]在牛血红蛋白水解液中分离出27 种抗菌肽。本文对近年来肉源性活性肽的制备方法和功能进行综述，并简单总结了计算机技术在活性肽发掘中的应用。

1 肉源性活性肽的制备方法

肉类蛋白质中含有许多活性片段，只有在合适的条件下才能从前体蛋白中释放[12]。在肉制品加工过程中，肉类蛋白质在内源酶和外源酶的作用下会产生许多肽段，这些肽段中只有一部分肽序列具有生物活性。生物活性肽若要在食用后仍能发挥其生理作用，需要活性肽在进入人体后的肠内运输过程中保持其完整性，且不被消化道中的酶水解，才能够穿过肠膜并完整地进入血液。目前的研究中，常使用酶解法、微生物发酵法以及模拟胃肠道消化法水解肉类蛋白质，制备肉源性活性肽。

1.1 酶解法

制备生物活性肽最常用的方法是使用动物、植物或微生物来源的商业肽酶水解蛋白质。通常用于蛋白质水解的肽酶主要有木瓜蛋白酶、热溶血素、碱性磷酸酶、中性酶、黄曲酶或放线酶E等，每种酶的切割位点都不相同，如胰蛋白酶优先切割精氨酸或赖氨酸后的肽键，糜蛋白酶切割酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的羧基形成的肽键等[13]。选择合适的酶切割对肽的释放具有重要的作用。Wu Hao等[14]使用蛋白酶SM98011消化鲨鱼肉获取血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽;Kim等[15]使用6 种不同的蛋白酶对鹿肉进行酶解，其中木瓜蛋白酶酶解产物的抗氧化活性最高。在大多数研究中常常将2 种以上的酶结合使用，从而提高活性肽的产率[16]。Kang Le等[17]使用复合蛋白酶和风味蛋白酶制备牛肉水解液，并将水解液纯化后鉴定其中的风味前体肽。酶解法在实际应用中也存在一些不足，如酶的成本高昂、回收利用率低以及酶解条件要求高等，但在现有技术条件下，利用固定化酶的方法可以提高酶的回收利用率[18]。杨小翠[19]利用纳米磺化聚苯乙烯微球固定枯草芽孢杆菌蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮胶原蛋白，在重复使用5 次固定化酶后，酶相对活性仍然可保留68.7%，与仅只能使用1 次的商业酶相比，极大节约了成本。

1.2 微生物发酵法

微生物发酵法是在肉自身内源酶与微生物的联合作用下丰富发酵产物中的肽种类。许多微生物能产生外切肽酶，其可以减少苦味肽的产生[20]。微生物发酵法还具有微生物来源广、繁殖快、成本低和蛋白酶产量高的优点。Jemil等[21]使用莫哈文芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）A21发酵斑马鱼获取抗菌肽。Ohata等[22]用酒曲作为发酵剂制备发酵酸肉，并鉴定出具有抗氧化活性的三肽。已有许多活性肽在一些传统发酵肉制品中被发现，并在体外实验中验证其功能活性，如我国宣威火腿和金华火腿中存在许多抗氧化肽和ACE抑制肽[23-25]。然而，微生物发酵法周期长，发酵酶系复杂，并且一些微生物的安全性仍然存在争议，这也意味着需要在前期准备中耗费大量时间筛选合适的微生物。de Almeida等[26]使用4 种常见的乳杆菌作为发酵剂发酵低盐香肠，比较不同菌种和发酵时间下肽的释放规律，发现弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）发酵的低盐香肠中产生的低分子质量肽最多。还有许多研究将发酵法与酶解法结合使用以丰富肉制品中的活性肽[8]。

1.3 模拟胃肠道消化法

胃肠道消化法常用于研究蛋白质在胃肠液中经过消化酶水解后产生的生物活性肽。由于参与胃肠道消化过程中的酶可能会对摄入的肽产生酶解修饰作用，导致一些在体外具有生物活性的肽在体内无法表现出其活性，因此该方法还被用于评估活性肽的生物利用度。

在研究中常用到的消化酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶[27-28]。Jiang Shui等[29]模拟了胃液的酸性环境，先使用胃蛋白酶对4 种中国干腌火腿进行模拟消化，改变pH值使胃蛋白酶失活，再加入胰蛋白酶消化，以获得不同干腌火腿的蛋白质谱图和肽谱。Gallego等[30]在酸性环境中添加胃蛋白酶对干腌火腿进行胃液消化，再通过改变pH值并加入胰蛋白酶、糜蛋白酶和胰脂肪酶模拟肠液环境消化，最终在消化后产物中鉴定得到抗氧化肽。此外，还可以使用活体进行胃肠道消化，Sayd等[31]在小型猪胃体大弯长轴中间处安装一个永久性插管，在小型猪摄入熟制牛肉后，每5 h收集消化液，研究结果揭示了体内胃消化过程中肽释放的动力学。

2 肉源性活性肽的分类及功能

2.1 ACE抑制肽

高血压已成为一个日益严重的健康问题，影响到全球1/3的成年群体，尤其是发达国家[32]。ACE能够催化血管紧张素Ⅰ转变成致使血管收缩的血管紧张素Ⅱ，同时使血管舒张作用的缓激肽失活，从而导致血压升高[33]。因此，抑制ACE的活性能够减少血管紧张素Ⅱ的产生，提高缓激肽浓度，从而能够有效降低血压并且预防和治疗高血压及其相关疾病[34]。目前，市场上已存在許多抑制ACE酶活性的降血压药物，如普利类降压药。ACE抑制肽C末端氨基酸与ACE抑制活性密切相关，当末端氨基酸为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸这些疏水性氨基酸时，ACE抑制活性更高。

目前，通常采用体外ACE抑制活性进行肽的降压活性评价。ACE在体内会特异性地切割肽C末端的2 个氨基酸，选用含有马尿酸的三肽如HHL作为底物，加入ACE与ACE抑制剂反应后，通过测定马尿酸含量可以获得样品的ACE抑制率[35]。但体外ACE抑制活性的评价结果还需通过体内抑制活性进一步验证，这是由于这些肽可能在胃肠道消化过程中被水解，从而使其抑制活性降低。

Mora等[36]在伊比利亚干腌火腿的研究中发现，3 种重复次数最多的氨基酸序列（PPK、PAP与AAP）具有较高的ACE抑制活性。Martini等[37]研究发现，猪肉、牛肉、鸡肉和火鸡肉分别经过胃肠道消化后，所有肉类消化物中均检测到ACE抑制活性肽，其中，鸡肉消化物的ACE抑制活性最高，且ACE抑制肽种类也最多，达到24 种。Saeed等[38]对肉类副产物心、肾和肝进行酶解，考察不同样品酶解产物的ACE抑制率随酶解时间的变化，结果表明，酶解时间与ACE抑制活性呈正相关，其中肝酶解产物的ACE抑制活性最高。

2.2 抗氧化肽

根据所涉及的化学反应，肽的抗氧化活性主要以2 种方式体现：一种是在竞争性反应中通过供氢以减少自由基的产生，评价方法包括氧自由基吸收能力测定（oxygen radical absorbance capacity assay，ORAC）、总自由基捕集抗氧化参数和β-胡萝卜素漂白实验;另一种是转移电子以减少氧化剂，评价方法包括2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）阳离子自由基、1，1-二苯基-2-吡啶肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除实验以及铁离子还原抗氧化能力测定。抗氧化肽大多含有4～16 个氨基酸，分子质量为400～2000 Da[39]。已有研究证明，肽的抗氧化特性与肽的组成、结构和疏水性有密切关系。当肽序列中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸时，肽链表现出自由基清除活性，且这些氨基酸在肽链中的重复次数和排列方式均会对肽链的抗氧化性产生显著影响[40]。

我国宣威火腿、金华火腿和羊肉火腿[41]以及西班牙干腌火腿中均已鉴定出多种抗氧化肽。与宣威火腿中抗氧化肽DLEE（74.45%）相比，金华火腿中抗氧化肽GKFNV的DPPH自由基清除率达到90.31%，抗氧化能力更高[23-24]。Gallego等[42-43]在西班牙干腌火腿中分离鉴定出2 种抗氧化肽SNAAC与AEEEYPDL，其ORAC分别为3 097.04 nmol/mg和960.04 nmol/mg（以α-生育酚当量计算），ABTS阳离子自由基清除能力分别为2 737.4 nmol/mg和1 474.08 nmol/mg，表明肽SNAAC的抗氧化性更好。一些副产物中也含有许多抗氧化肽。如鸡冠经碱性磷酸酶水解后可得到2 种抗氧化肽GADGAP和GKDGCR;鸭血浆经碱性蛋白酶酶解后分离鉴定出7 种抗氧化肽LDGP、TGVGTK、EVGK、RCLQ、LHDVK、KLGA以及AGGVPAG，其中EVGK的Fe2+螯合能力最强[10]。

2.3 抗菌肽

近年来，由于抗生素的滥用导致许多细菌产生抗药性，甚至出现超级细菌[45-46]。由于抗菌谱广、且不会使细菌产生耐药性，抗菌肽引起了人们的关注。抗菌肽的抗菌活性因肽长度、电荷、疏水性、氨基酸组成和二级结构的不同而不同[47]。Powers等[48]在揭示抗菌肽结构-活性关系的研究中发现，具有抗菌活性的肽需要具备阳离子电荷和誘导双亲构象2 个基本要求。Castellano等[49]从西班牙干腌火腿中筛选具有抗单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）的多肽，合成活性组分中的12 个肽并验证其抗菌性，发现共有10 个肽具有抑制单核细胞李斯特菌活性，其中抑菌肽RHGYM的抑菌活性最高，其最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）为6.25 mmol/L。从鸭中鉴定得到的一种新型抗菌肽dCATH具有146 个氨基酸，其可通过增加细胞膜通透性破坏微生物细胞膜的完整性，从而杀死微生物。大量研究证明，血红蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性，一些已被发现的抗菌肽也往往来源于血红蛋白。Yang Shen等[51]利用生物信息学技术从大黄鱼血红蛋白中鉴定出一种新型抗菌肽LCH4，其肽序列为AWQKFLSAVVSALGR，LCH4对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）均有抑制作用，并能通过穿透细菌的细胞壁杀死细菌，导致细胞内容物外泄和细胞膜崩塌。Adje等[11]从牛血红蛋白水解液中分离出26 种抗菌肽，均能抑制黄体微球菌（Micrococcus luteus）A270、无害李斯特菌（Listeria innocua）和大肠杆菌（Escherichia coli）的生长，MIC为1.0～187.1 μmol/L，肽TSKYR对无害李斯特菌的MIC最低，仅为1 μmol/L。

2.4 DPP-Ⅳ抑制肽

糖尿病主要包括Ⅰ型糖尿病和2型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病的患者高达90%以上，Ⅱ型糖尿病的病因主要与机体调节血糖能力相关。二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）是一种与血糖调节相关的酶，能降解胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。GLP-1与葡萄糖依赖性胰岛素样肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）都属于肠促胰岛素，行使促胰岛素分泌的功能，在食物进入人体后被释放，以维持人体餐后血糖水平。GLP-1经DPP-Ⅳ降解后，活性丧失，削弱了其降血糖效果[52]。市售降糖药中，磷酸西格列汀、沙格列汀、利格列汀和维格列汀等均是通过抑制DPP-Ⅳ活性降低血糖。

目前，许多肉源性活性肽被证明具有抑制DPP-Ⅳ效果，并且相比鸡肉、牛肉而言，猪肉是DPP-Ⅳ抑制肽的重要来源。Martini等[37]对鸡肉、牛肉和猪肉进行模拟胃肠道消化，从猪肉模拟胃肠道消化物中鉴定出DPP-Ⅳ抑制肽的种类最多;Lafarga等[53]也通过计算机技术得出相同结论，即与牛肉蛋白相比，DPP-Ⅳ抑制肽更多来源于猪肉。Haredy-Rothwell等[54]在方鲷蛋白水解液中发现的肽IPVDM具有强烈的DPP-Ⅳ抑制活性，IC50达到21.72 μmol/L。Jin Ritian等[55]酶解三文鱼鱼皮胶原蛋白后，从胰蛋白酶酶解产物中鉴定出DPP-Ⅳ抑制肽LDKVFR，体外抑制DPP-Ⅳ的IC50为0.1 mg/mL。Gallego等[56]从西班牙干腌火腿中发现9 种肽对DPP-Ⅳ均具有抑制作用，其中抑制作用最强的肽KA和AAATP的IC50分别为6.27 mmol/L和6.47 mmol/L。

2.5 其他活性肽

除上述活性肽以外，从肉中还鉴定出抗炎肽、阿片肽和α-葡萄糖苷酶抑制肽等。抗炎肽可以调节细胞因子的产生，刺激巨噬细胞活性，抗炎肽在肉品中常见于鱼肉及其副产物。采用胃蛋白酶酶解鲟鱼蛋白产生的肽KIWHHTF、VHYAGTVDY以及HLDDALRGQE能够提高脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的巨噬细胞RAW264.7中SOD活性，降低炎癥细胞因子的释放[57]。Durand等[58]从鲱鱼鱼糜中分离出2 种新型抗炎肽IVPAS和FDKPVSPLL，能抑制LPS诱导巨噬细胞产生一氧化氮，在质量浓度1 ng/mL时抑制率分别为11.8%和12.0%。阿片肽对人体内阿片类受体具有良好的亲和力，与阿片类受体结合后，在体内发挥神经调节剂的作用，这种作用具有两面性，能干预痛觉，改变情绪以及影响行为反应等[59]。Piot等[60]在牛血红蛋白消化物中鉴定出2 种阿片肽VVYPWTQRF和LVVWPWTQRF。最近的研究中，Mora等[61]在伊比利亚干腌香肠中发现α-葡萄糖苷酶抑制肽，其能有效延缓碳水化合物的消化，减少碳水化合物对血糖水平的影响，并降低高血糖。在已鉴定出的α-葡萄糖苷酶抑制肽中，有8 种肽还具有其他生物活性，如在西班牙干腌火腿中发现的肽AEEEYPDL，不仅具有α-葡萄糖苷酶抑制活性还具有抗氧化活性[43]。

已有许多研究证明肽可以同时具备多种生物活性，如Tyr-Pro-D-Ala-NH2既具有抗炎性，还具有DPP-Ⅳ抑制活性[62]。从鸡肉中鉴定出的ACE抑制肽IWHHT能显著降低肿瘤坏死因子诱导的炎症反应中血管细胞黏附分子-1的表达，表现出抗炎作用[63]。

3 计算机分析技术在肉源活性肽中的应用

近些年，关于活性肽的研究越来越多，但是在研究过程中对活性肽的分离鉴定仍然存在困难，分离活性肽消耗周期长，需要使用的大型精密仪器多。在分离鉴定过程中常使用到超滤、葡聚糖凝胶分离、阴离子交换、尺寸排阻色谱和反相高效液相色谱等技术对活性肽进行分离纯化，再通过液相色谱-串联质谱鉴定肽序列。

随着生物信息学技术逐渐普及和应用，活性肽的发掘形成新的方向，利用计算机技术对蛋白质或肽进行分析和预测。根据功能可以将其划分为4 类：对某种蛋白质作为活性肽来源的效能评价、预测不同条件下蛋白质水解后产生的肽、肽序列的生物活性分析和肽序列的化学性质分析。常用的活性肽分析工具包括BIOPEP、Peptide Ranker、Peptide Cutter和ExPASy computer PI/MW Tool等，具体功能见表5。

3.1 蛋白质的效能评价

许多研究者借助计算机分析技术对肉源性活性肽进行效能评价，以评估某一蛋白质中潜在的活性肽序列含量，判断该蛋白质是否能作为目标活性肽的来源。在开展这一工作前需要获取该蛋白质的一些基本信息，常用的工具有UniPort、NCBI Protein Database和BIOPEP。对蛋白质进行效能评价时，一般使用BIOPEP中的Profiles of Potential Biological Activity对蛋白质中的生物活性肽进行分析，获得潜在生物活性，通过计算基于蛋白质链中生物活性片段的出现概率和蛋白质中某活性肽的潜在活性，以衡量蛋白质作为生物活性肽潜在前体的价值[64]。Keska等[65]对猪骨骼肌中的16 种蛋白质进行效能评价，研究这些蛋白作为DPP-Ⅳ抑制肽以及葡萄糖摄取刺激肽来源的可行性，发现肌联蛋白和肌浆蛋白是DPP-Ⅳ抑制肽的最佳前体蛋白。

3.2 模拟酶及化学作用水解

模拟酶水解是活性肽研究中的热门方法。每种酶均会有其固定的切割位点，在不考虑任何化学修饰及其他因素影响的情况下，通过对蛋白质可能的产物进行分析，从而筛选出有利于目标产物生产的酶或酶组合。BIOPEP中的Enzyme（s） Action以及Peptide Cutter模块常被用于模拟蛋白质酶解，以获得酶解后蛋白质产生的肽序列及在前体蛋白中的位置。BIOPEP在获得模拟水解产物后，能进一步寻找产物中的活性肽或计算表征蛋白水解的定量参数。Peptide Cutter还能模拟蛋白质化学处理后的断裂位点。Lafarga等[66]利用Peptide Cutter模拟猪肉和牛肉源蛋白质在热溶血素和胃蛋白酶作用下的水解，再通过BIOPEP预测无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产生的ACE-Ⅰ、肾素和DPP-Ⅳ抑制肽的分布，发现猪肉源蛋白质中含有大量的潜在DPP-Ⅳ抑制肽。同样，K?ska等[13]对筛选出的8 种猪纤维蛋白进行计算机分析，用BIOPEP模拟胃肠道消化后胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解产生的活性肽，结果表明，DPP-Ⅳ抑制肽序列出现的频率最高，肌动蛋白、伴肌动蛋白和肌联蛋白中产生的活性肽片段最多。

3.3 肽序列活性的预测及化学性质分析

对肽序列的活性分析能提高生物资源的利用度。Peptide Ranker分析肽活性的方式是对输入的不同肽序列可能有活性的概率进行评分，并根据分数的高低从“0”到“1”排序。但这个评分并不是指肽的活性能力强弱，而是存在活性的概率[67]。BIOPEP中有全面的生物活性肽数据库，除BIOPEP外，还有很多单一功能的肽序列库，如降血压肽数据库（AHTPDB）、抗菌肽数据库（APD）和抗癌蛋白肽数据库（CancerPPD）等。还有许多预测肽序列化学性质的工具，如ExPASy computer PI/MW Tool，具有分析理论分子质量、理论等电点值、疏水性以及绘制肽的理论结构图等功能。此外，还有预测肽序列是否具有致敏性[68]和毒性[69]的工具。

计算机分析技术为生物活性肽的发现和鉴定提供了新的思路。利用计算机分析技术，获取蛋白质氨基酸序列后，通过对其作为活性肽的前体蛋白进行效能评价，再对需要研究的蛋白质模拟酶解，分析不同酶作用下产生的活性肽差异，从而为实验提供研究方向。此外，通过鉴定的肽序列，还可以预测其生物活性、化学性质和理论结构图，辨别肽的生物安全性。

4 结 语

目前关于生物活性肽的研究日趋丰富，研究人员已从鲜肉、肉制品和肉类副产物中分离鉴定出多种活性肽。但关于肉源性抗癌肽、降脂肽、刺激肽、螯合肽的相关研究不足，可能與原料肉处理和分离提纯技术有关。目前，活性肽的应用仍面临着挑战，肉品的粗肽溶液中肽的数量虽然较多，但有活性的肽浓度偏低，活性肽纯化后纯度也较低;在粗肽溶液中，肽之间存在协同和拮抗作用，单一肽可能不表现出活性;纯品肽通常呈现出疏水性，易析出结晶;对活性肽的研究大部分停留在体外和体内实验，临床实验不足;这些都是限制活性肽发展亟需改善和解决的问题。计算机分析技术的推广促进生物活性肽的发现，能为发掘肽的活性提供理论基础，具有巨大的现实意义，也是未来研究活性肽的重要手段。

参考文献：

[1] TOLDRA F， GALLEGO M， REIG M， et al. Bioactive peptides generated in the processing of dry-cured ham[J]. Food Chemistry， 2020： 126689. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.126689.

[2] ZHOU Changyu， PAN Daodong， BAI Yun， et al. Evaluating endogenous protease of salting exudates during the salting process of Jinhua ham[J]. LWT-Food Science and Technology， 2019， 101： 76-82. DOI：10.1016/j.lwt.2018.11.026.

[3] ESCUDERO E， SENTANDREU M A， ARIHARA K， et al. Angiotensin i-converting enzyme inhibitory peptides generated from in vitro gastrointestinal digestion of pork meat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（5）： 2895-2901. DOI：10.1021/jf904204n.

[4] LOPEZ C M， BRU E， VIGNOLO G M， et al. Identification of small peptides arising from hydrolysis of meat proteins in dry fermented sausages[J]. Meat science， 2015， 104： 20-29. DOI：10.1016/j.meatsci.2015.01.013.

[5] MORA L， TOLDRA-REIG F， REIG M， et al. Meat by-products： new insights into potential technical and health applications[J]. Novel Proteins for Food， Pharmaceuticals， and Agriculture： Sources， Applications， and Advances， 2018： 101-116. DOI：10.1002/9781119385332.ch5.

[6] YANG Hua， LIU Yuhua， KONG Baohua， et al. Hydrolyzing condition and immunocompetence of sheep bone protein enzymatic lysates[J]. Agricultural Sciences in China， 2009， 8（11）： 1332-1338. DOI：10.1016/S1671-2927（08）60345-4.

[7] WANG Xueqi， ZHANG Zhen， XU Hongyan， et al. Preparation of sheep bone collagen peptide-calcium chelate using enzymolysis-fermentation methodology and its structural characterization and stability analysis[J]. RSC Advances， 2020， 10（20）： 11624-11633. DOI：10.1039/d0ra00425a.

[8] 尹剑， 武瑞赟， 阿热爱， 等. 酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力[J]. 肉类研究， 2020， 34（2）： 33-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191021-247.

[9] LEE E J， HUR J， HAM S A， et al. Fish collagen peptide inhibits the adipogenic differentiation of preadipocytes and ameliorates obesity in high fat diet-fed mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2017， 104： 281-286. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2017.05.151.

[10] YANG Jing， HUANG Jichao， DONG Xiaoli， et al. Purification and identification of antioxidant peptides from duck plasma proteins[J]. Food Chemistry， 2020， 319： 126534. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.126534.

[11] ADJE E Y， BALTI R， KOUACH M， et al. Obtaining antimicrobial peptides by controlled peptic hydrolysis of bovine hemoglobin[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2011， 49（2）： 143-153. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2011.04.004.

[12] ZAMBROWICZ A， TIMMER M， POLANOWSKI A， et al. Manufacturing of peptides exhibiting biological activity[J]. Amino acids， 2013， 44（2）： 315-320. DOI：10.1007/s00726-012-1379-7.

[13] K?SKA P， STADNIK J. Porcine myofibrillar proteins as potential precursors of bioactive peptides： an in silico study[J]. Food and Function， 2016， 7（6）： 2878-2885. DOI：10.1039/c5fo01631b.

[14] WU Hao， HE Hailun， CHEN Xiulan， et al. Purification and identification of novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from shark meat hydrolysate[J]. Process Biochemistry， 2008， 43（4）： 457-461. DOI：10.1016/j.procbio.2008.01.018.

[15] KIM E K， LEE S J， JEON B T， et al. Purification and characterization of antioxidative peptides from enzymatic hydrolysates of venison protein[J]. Food Chemistry， 2009， 114（4）： 1365-1370. DOI：10.1016/j.foodchem.2008.11.035.

[16] GU Yuxiang， LI Xing， LIU Haiyan， et al. The impact of multiple-species starters on the peptide profiles of yoghurts[J]. International Dairy Journal， 2020，106： 104684. DOI：10.1016/j.idairyj.2020.104684.

[17] KANG Le， ALIM A， SONG Huanlu. Identification and characterization of flavor precursor peptide from beef enzymatic hydrolysate by Maillard reaction[J]. Journal of Chromatography B， 2019， 1104： 176-181. DOI：10.1016/j.jchromb.2018.10.025.

[18] JUNIOR E C S， SANTOS M P F， SAMPAIO V S， et al. Hydrolysis of casein from different sources by immobilized trypsin on biochar： effect of immobilization method[J]. Journal of Chromatography B， 2020， 1146： 122124. DOI：10.1016/j.jchromb.2020.122124.

[19] 楊小翠. 纳米微球固定化酶制备鱼皮胶原多肽及其抗氧化活性研究[D]. 广州： 华南理工大学， 2019. DOI：10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.003114.

[20] ZHAO C J， SCHIEBER A， GANZLE M G. Formation of taste-active amino acids， amino acid derivatives and peptides in food fermentations： a review[J]. Food Research International， 2016， 89： 39-47. DOI：10.1016/j.foodres.2016.08.042.

[21] JEMIL I， ABDELHEDI O， MORA L， et al. Peptidomic analysis of bioactive peptides in zebra blenny （Salaria basilisca） muscle protein hydrolysate exhibiting antimicrobial activity obtained by fermentation with Bacillus mojavensis A21[J]. Process Biochemistry， 2016， 51（12）： 2186-2197. DOI：10.1016/j.procbio.2016.08.021.

[22] OHATA M， UCHIDA S， ZHOU L， et al. Antioxidant activity of fermented meat sauce and isolation of an associated antioxidant peptide[J]. Food Chemistry， 2016， 194： 1034-1039. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.08.089.

[23] ZHU Chaozhi， ZHANG Wangang， ZHOU Guanghong， et al. Isolation and identification of antioxidant peptides from Jinhua ham[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013， 61（6）： 1265-1271. DOI：10.1021/jf3044764.

[24] XING Lujuan， HU Yaya， HU Hongyan， et al. Purification and identification of antioxidative peptides from dry-cured Xuanwei ham[J]. Food Chemistry， 2016， 194： 951-958. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.08.101.

[25] WANG Le， LI Xiang， LI Yingnan， et al. Antioxidant and angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities of Xuanwei ham before and after cooking and in vitro simulated gastrointestinal digestion[J]. Royal Society Open Science， 2018， 5（7）： 180276. DOI：10.1098/rsos.180276.

[26] DE ALMEIDA M A， SALDANA E， DA SILVA PINTO J S， et al. A peptidomic approach of meat protein degradation in a low-sodium fermented sausage model using autochthonous starter cultures[J]. Food research international， 2018， 109： 368-379. DOI：10.1016/j.foodres.2018.04.042.

[27] NGUYEN H T H， GATHERCOLE J L， DAY L， et al. Differences in peptide generation following in vitro gastrointestinal digestion of yogurt and milk from cow， sheep and goat[J]. Food Chemistry， 2020， 317： 126419. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.126419.

[28] GONG Pixian， WANG Bingku， WU Yanchao， et al. Release of antidiabetic peptides from Stichopus japonicas by simulated gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry， 2020， 315： 126273. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.126273.

[29] JIANG Shui， XIA Dong， ZHANG Danni， et al. Analysis of protein profiles and peptides during in vitro gastrointestinal digestion of four Chinese dry-cured hams[J]. LWT-Food Science and Technology， 2020， 120： 108881. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108881.

[30] GALLEGO M， MAURI L， ARISTOY M C， et al. Antioxidant peptides profile in dry-cured ham as affected by gastrointestinal digestion[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 69： 103956. DOI：10.1016/j.jff.2020.103956.

[31] SAYD T， DUFOUR C， CHAMBON C， et al. Combined in vivo and in silico approaches for predicting the release of bioactive peptides from meat digestion[J]. Food Chemistry， 2018， 249： 111-118. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.01.013.

[32] AHHMED A M， MUGURUMA M. A review of meat protein hydrolysates and hypertension[J]. Meat Science， 2010， 86（1）： 110-118. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.04.032.

[33] BALTI R， BOUGATEF A， SILA A， et al. Nine novel angiotensin I-converting enzyme （ACE） inhibitory peptides from cuttlefish （Sepia officinalis） muscle protein hydrolysates and antihypertensive effect of the potent active peptide in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry， 2015， 170： 519-525. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.03.091.

[34] 林凱， 韩雪， 张兰威， 等. ACE抑制肽构效关系及其酶法制备的研究进展[J]. 食品科学， 2017， 38（3）： 279-288. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703042.

[35] PAN Saikun， WANG Shujun， JING Lingling， et al. Purification and characterization of a novel angiotensin-Ⅰ converting enzyme （ACE）-inhibitory peptide derived from the enzymatic hydrolysate of Enteromorpha clathrata protein[J]. Food Chemistry， 2016， 211： 423-430. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.05.087.

[36] MORA L， ESCUDERO E， ARIHARA K， et al. Antihypertensive effect of peptides naturally generated during Iberian dry-cured ham processing[J]. Food Research International， 2015， 78： 71-78. DOI：10.1016/j.foodres.2015.11.005.

[37] MARTINI S， CONTE A， TAGLIAZUCCHI D. Comparative peptidomic profile and bioactivities of cooked beef， pork， chicken and turkey meat after in vitro gastro-intestinal digestion[J]. Journal of Proteomics， 2019， 208： 103500. DOI：10.1016/j.jprot.2019.103500.

[38] SAEED M， KHAN M I， BUTT M S， et al. Characterization of peptides fractions produced through enzymatic hydrolysis of meat byproducts for their antihypertensive and antioxidant activities[J]. Pakistan Journal of Agricultural Sciences， 2020， 57（2）： 545-551. DOI：10.21162/PAKJAS/19.8506.

[39] LIU Rui， XING Lujuan， FU Qingquan， et al. A review of antioxidant peptides derived from meat muscle and by-products[J]. Antioxidants， 2016， 5（3）： 17-32. DOI：10.3390/antiox5030032.

[40] SAMARANAYAKA A G P， LI-CHAN E C Y. Food-derived peptidic antioxidants： a review of their production， assessment， and potential applications[J]. Journal of Functional Foods， 2011， 3（4）： 229-254. DOI：10.1016/j.jff.2011.05.006.

[41] WANG Jingyun， LU Shiling， LI Ruiting， et al. Identification and characterization of antioxidant peptides from Chinese dry-cured mutton ham[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2020， 100（3）： 1246-1255. DOI：10.1002/jsfa.10136.

[42] GALLEGO M， MORA L， REIG M， et al. Stability of the potent antioxidant peptide SNAAC identified from Spanish dry-cured ham[J]. Food Research International， 2018， 105： 873-879. DOI：10.1016/j.foodres.2017.12.006.

[43] GALLEGO M， MORA L， TOLDRA F. Characterisation of the antioxidant peptide AEEEYPDL and its quantification in Spanish dry-cured ham[J]. Food Chemistry， 2018， 258： 8-15. DOI：10.1016/j.foodchem.2018.03.035.

[44] BEZERRA T， ESTEVEZ M， LACERDA J T， et al. Chicken combs and wattles as sources of bioactive peptides： optimization of hydrolysis， identification by LC-ESI-MS2 and bioactivity assessment[J]. Molecules， 2020， 25（7）： 1698. DOI：10.3390/molecules25071698.

[45] SOFOS J N. Challenges to meat safety in the 21st century[J]. Meat Science， 2008， 78（1/2）： 3-13. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.07.027.

[46] BOSKOVIC M， BOSKOVIC M ?， IVANOVIC J， et al. Use of essential oils in order to prevent foodborne illnesses caused by pathogens in meat[J]. Tehnologija Mesa， 2013， 54（1）： 14-20. DOI：10.5937/tehmesa1301014B.

[47] TORRES M D T， SOTHISELVAM S， LU T K， et al. Peptide design principles for antimicrobial applications[J]. Journal of Molecular Biology， 2019， 431（18）： 3547-3567. DOI：10.1016/j.jmb.2018.12.015.

[48] POWERS J P S， HANCOCK R E W. The relationship between peptide structure and antibacterial activity[J]. Peptides， 2003， 24（11）： 1681-1691. DOI：10.1016/j.peptides.2003.08.023.

[49] CASTELLANO P， MORA L， ESCUDERO E， et al. Antilisterial peptides from Spanish dry-cured hams： purification and identification[J]. Food Microbiology， 2016， 59： 133-141. DOI：10.1016/j.fm.2016.05.018.

[50] GAO Wei， XING Liwei， QU Pei， et al. Identification of a novel cathelicidin antimicrobial peptide from ducks and determination of its functional activity and antibacterial mechanism[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 17260. DOI：10.1038/srep17260.

[51] YANG Shen， DONG Yuting， AWEYA J J， et al. A hemoglobin-derived antimicrobial peptide， LCH4， from the large yellow croaker （Larimichthys crocea） with potential use as a food preservative[J]. LWT-Food Science and Technology， 2020， 131： 109656. DOI：10.1016/j.lwt.2020.109656.

[52] DEACON C F. Peptide degradation and the role of DPP-4 inhibitors in the treatment of type 2 diabetes[J]. Peptides， 2018， 100： 150-157. DOI：10.1016/j.peptides.2017.10.011.

[53] LAFARGA T， OCONNOR P， HAYES M. Identification of novel dipeptidyl peptidase-Ⅳ and angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from meat proteins using in silico analysis[J]. Peptides， 2014， 59： 53-62. DOI：10.1016/j.peptides.2014.07.005.

[54] HAREDY-ROTHWELL P A， MCLAUGHLIN C M， O'KEEFFE M B， et al. Identification and characterisation of peptides from a boarfish （Capros aper） protein hydrolysate displaying in vitro dipeptidyl peptidase-Ⅳ （DPP-Ⅳ） inhibitory and insulinotropic activity[J]. Food Research International， 2020， 131： 108989. DOI：0.1016/j.foodres.2020.108989.

[55] JIN Ritian， TENG Xiangyu， SHANG Jiaqi， et al. Identification of novel DPP-Ⅳ inhibitory peptides from Atlantic salmon （Salmo salar） skin[J]. Food Research International， 2020， 133： 109161. DOI：10.1016/j.foodres.2020.109161.

[56] GALLEGO M， ARISTOY M C， TOLDRA F. Dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitory peptides generated in Spanish dry-cured ham[J]. Meat science， 2014， 96（2）： 757-761. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.09.014.

[57] GAO Ruichang， SHU Wanghui， SHEN Yang， et al. Sturgeon protein-derived peptides exert anti-inflammatory effects in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages via the MAPK pathway[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 72： 104044. DOI：10.1016/j.jff.2020.104044.

[58] DURAND R， PELLERIN G， THIBODEAU J， et al. Screening for metabolic syndrome application of a herring by-product hydrolysate after its separation by electrodialysis with ultrafiltration membrane and identification of novel anti-inflammatory peptides[J]. Separation and Purification Technology， 2020， 235： 116205. DOI：10.1016/j.seppur.2019.116205.

[59] KAUR J， KUMAR V， SHARMA K， et al. Opioid peptides： an overview of functional significance[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics， 2020， 26（1）： 33-41. DOI：10.1007/s10989-019-09813-7.

[60] PIOT J M， ZHAO Q， GUILLOCHON D， et al. Isolation and characterization of two opioid peptides from a bovine hemoglobin peptic hydrolysate[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1992， 189（1）： 101-110. DOI：10.1016/0006-291X（92）91531-T.

[61] MORA L， GONZALEZ-ROGEL D， HERES A， et al. Iberian dry-cured ham as a potential source of α-glucosidase-inhibitory peptides[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 67： 103840. DOI：10.1016/j.jff.2020.103840.

[62] SALAGA M， BINIENDA A， DRACZKOWSKI P， et al. Novel peptide inhibitor of dipeptidyl peptidase Ⅳ （Tyr-Pro-D-Ala-NH2） with anti-inflammatory activity in the mouse models of colitis[J]. Peptides， 2018， 108： 34-45. DOI：10.1016/j.peptides.2018.08.011.

[63] GU Yuchen， LIANG Ying， BAI Jie， et al. Spent hen-derived ACE inhibitory peptide IWHHT shows antioxidative and anti-inflammatory activities in endothelial cells[J]. Journal of Functional Foods， 2019， 53： 85-92. DOI：10.1016/j.jff.2018.12.006.

[64] MINKIEWICZ P， IWANIAK A， DAREWICZ M. BIOPEP-UWM database of bioactive peptides： current opportunities[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（23）： 5978. DOI：10.3390/ijms20235978.

[65] KESKA P， STADNIK J， BAK O， et al. Meat Proteins as dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitors and glucose uptake stimulating peptides for the management of a type 2 diabetes mellitus in silico study[J]. Nutrients， 2019， 11（10）： 2537. DOI：10.3390/nu11102537.

[66] LAFARGA T， OCONNOR P， HAYES M. Identification of novel dipeptidyl peptidase-Ⅳ and angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from meat proteins using in silico analysis[J]. Peptides， 2014， 59： 53-62. DOI：10.1016/j.peptides.2014.07.005.

[67] TU M， LIU H， ZHANG R， et al. Bioactive hydrolysates from casein： generation， identification， and in silico toxicity and allergenicity prediction of peptides[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2018， 98（9）： 3416-3426. DOI：10.1002/jsfa.8854.

[68] DIMITRO I， FLOWER D R， DOYECHINOVA I. AllerTOP-a server for in silico prediction of allergens[J]. BMC Bioinformatics， 2013， 14（6）： S4. DOI：10.1186/1471-2105-14-s6-s4.

[69] 蔡俊泰， 徐芷茵， 徐國强， 等. 决明子蛋白水解产物的抗氧化活性： 热和胃肠稳定性，肽鉴定和计算机分析[J]. 现代食品科技， 2019， 35（9）： 38-48. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.9.004.