张琳琳 刘刚 方俊

摘要    由于具有高效、便捷、灵敏和低廉的特点，发光细菌已成为水质急性毒性快速检测的首选，在国内外被广泛应用于环境监测中。本文对发光细菌的特性、种类、发光机理及其在农业水质检测方面的应用进行了综述，对发光细菌在农业水源污染检测中的前景作了展望。

关键词    发光细菌;生理特性;發光机理;农业用水;应用

中图分类号    X824        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）20-0162-03                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    Because of its high efficiency， convenience， sensitivity and low cost， luminescent bacteria have become the best choice for rapid detection of acute toxicity of water quality， and were widely used in environmental monitoring at home and abroad. In this paper， the characteristics， types， luminescence mechanism and application of agricultural water quality monitoring of luminescent bacteria were reviewed， and the prospect of luminescent bacteria in agricultural water quality monitoring was prospected.

Keywords    luminescent bacteria; physiological characteristic; luminescence mechanism; agricultural water; application

农业现代化发展的高速进程导致水体中毒性物质的物种丰度和种类不断增加，从而使水体质量监测成为了各界焦点。科研工作者已开发出许多灵敏、有效的水质毒性检测方法，大体可分为2种，即分析技术和生物毒性检测。分析技术主要用于检测废水和地表水指标，但其不能反映各指标由于生物的拮抗、协同、抑制等相互作用的综合毒性大小。利用生物学方法进行毒性检测越来越普遍，不断出现新的检测手段。在快速生物检测方法方面，根据测试生物的不同，可以分为微生物、藻类、底栖软体动物、浮游生物和鱼类等[1-2]。传统的生物毒性检测以水藻、水蚤类、鱼类作为主要测试对象，测试周期较长，工作量较大，对受试生物的筛选较严格。微生物中的发光细菌具有独特的生理特性，将其与光电传感技术相结合，形成的发光细菌毒性快速检测技术越来越引人注目。将传统的分析技术与发光细菌毒性检测技术联合进行水质分析，为保障水质安全提供了有力支持。发光细菌毒性是一种生物毒性，它能客观分析出逾5 000种有毒物质对周边环境以及生物物种的综合影响。由于高效、便捷、重复性好等优势，其在国内外被广泛应用于污水、工农业废水、生活饮用水、大气污染、土壤污染、食品等方面的检测。

1    发光细菌的生理特性及分类

发光细菌是指含有lux基因，在正常生理条件下，可发出波长在450～490 nm范围蓝绿色可见光的细菌[3]。它是一种兼性好氧化能自养型细菌[4]。

发光细菌的分类方式多种多样，包括传统分类、数值分类、系统分类等。迄今为止，在全世界范围内发现的发光细菌种类，大致可分为以下种类。一是发光杆菌属，包括鳆发光杆菌和明亮发光杆菌[5]。其中，明亮发光杆菌是从海洋中发现、提取、分离、纯化的，在测试过程中需要另外加入3%氯化钠才能保持正常的生理状态。目前，国内应用较多的是明亮发光杆菌T3和T502小种[6]。二是弧菌属，包括哈维氏弧菌、美丽弧菌、费氏弧菌、火神弧菌、东方弧菌、青海弧菌。另外，还有人发现霍乱弧菌和地中海弧菌中的某些菌株也有发光的现象。其中弧菌属中的霍乱弧菌和青海弧菌属于淡水型发光细菌。我国的发光细菌研究学者朱文杰教授从青海湖裸鲤鱼体表上分离纯化出一株淡水型发光细菌，命名为青海弧菌Q67，是全球唯一一株不具备致病性的淡水发光细菌，在使用过程中的调节盐浓度较低，对样品的毒性测定结果影响较小[7]。三是希瓦氏菌属，主要为羽田希瓦氏菌。

2    发光细菌的发光机理

发光细菌的最大特点为在它的生长周期过程中可以发出可见光，其发光机理与萤火虫相似，但并不完全相同。细菌自身能够分泌合成一种称为细菌荧光酶的酶，这种酶通过氧化还原型的黄素单核苷酸发出光子，这个反应过程不产热。因此，发光细菌的发光过程并不伴随产热，是一种“冷”光过程。细菌发光的波长范围为420～670 nm，在490 nm处可以达到最大发射波长，其光为蓝绿色。细菌发光的简略反应方程式如下：

不仅如此，细菌在发光过程中荧光酶还会涉及相应的有氧呼吸作用，人们通常认为这是促进呼吸作用中电子向氧分子转移的一条代谢信号通路。氧分子会促进FMNH2反应产生中间产物—荧光酶-黄素过氧化物，其氧化降解反应的过程中会产生大量能量（约210 kJ/mol），从而促进激发分子在击退过程中激发光子的产生。众所周知，生物的发光过程需要能量，而这个能量来源是来自于O-O键的断裂[8]。

污染物抑制细菌发光是主要通过以下2种方式：使参与细菌发光反应过程中的荧光酶失活;抑制细菌发光反应过程中相关的代谢信号通路。因此，可以根据细菌产光强度的变化来测定这些能够抑制发光细菌呼吸作用、新陈代谢以及生长过程的有毒物质毒性的大小[9]。重金属和有机污染物类物质对发光细菌的毒性最大，对其发光过程损伤最严重。通过光学波长检測仪可以检测发光强度的变化，从而可以利用发光细菌作为检测水体中有毒物质的有效手段[10]。

3    发光细菌在农业水质毒性检测中的应用

3.1    发光细菌应用于水体抗生素残留检测

由于集约化畜牧业的飞速发展，抗生素被广泛应用于生猪养殖业，造成了抗生素污染水体的严重农业污染。针对这类问题，我们可以利用发光细菌来检测养殖基地中所排放的水源中抗生素的急性毒性。曾  卓等就以明亮发光杆菌作为指示菌种，测定了生猪养殖产业中常用的包括林可霉素、青霉素G钠和杆菌肽在内的7种兽用抗生素的急性毒性[11]。

然而，传统的发光细菌检测方法采用的是天然发光细菌，海洋菌在测试时需要加入2%～3%氯化钠来调节盐度，会对水样的毒性测试结果产生影响。此外，天然发光细菌除了能检测重金属外，还会对几千种污染物质有响应，不能实现对特定污染物的高效识别。因此，人们在发光细菌的基础上，通过基因工程的方法，研发出了重组发光细菌检测方法。重组发光细菌是通过基因工程技术将发光基因重组到对污染物敏感的受体细胞所构成的基因工程[12]。发光细菌的发光操纵子系统中包括结构基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE和调节基因luxI、luxG、luxR等。不同发光细菌的发光基因的拷贝数和表达能力不同[13]。为了检测环境中某些特定污染物或其他目标特质，将lux基因导入选定的非发光细菌，人为构建基因工程发光细菌[14]，这一研究方向是近年来发光细菌研究的热点。此外，还可以通过基因编辑的手段来构建菌株以实现抗生素毒性的快速评价[15]。低浓度的二甲基亚砜可以在不影响青海弧菌Q67发光生理特性的前提下，提高其对抗生素毒性的检测敏感程度，大幅提高了发光细菌在抗生素毒性检测中的灵敏度以及效率[16]。

3.2    发光细菌应用于农药残留毒性检测

发光细菌毒性测试技术能够测试的物质范围广、灵敏度较传统的动物试验高、相关性好、重复性好、反应耗时短，因而在环境监测中被广泛应用[17]。根据发光细菌发光的原理，凡是能够影响发光细菌正常新陈代谢的物质均能用发光细菌发光强度变化的方法来进行定性或定量的测定。近年来，利用发光细菌来进行农业废水中农药残留安全监测越来越广泛[18]。

早有试验对发光细菌在农业废水中农药残留检测相关领域的监测应用情况进行了评估，同时还监测了多种农药的毒性变化。结果表明，在对水质的监测和评估过程中，单独采用化学参数的指标测试是不全面的，应该配合生物毒性测试手段进行多方面的水质监测[19]。有研究通过与化学检测的比较，对大型溞、斜生栅藻、费舍尔弧菌进行毒性检测效应评估，发现发光细菌对农药厂污染水源毒性的敏感性最高[20]。而对农药厂污染地土壤浸出液的毒性检测试验表明，与其他毒性检测生物相比，发光细菌试验周期更短。但这些受试生物的毒性效力都随着时间的增加而增加[21]。杨丽芳等针对食品蔬菜中的农药残留，使用发光细菌进行有机磷农药毒性的快速检测[22]。

4    结语

综上所述，发光细菌法的生物毒性检测技术在农业水质污染监测等方面已发挥出重要的作用。作为一种辅助监测手段，克服了理化监测的局限性和连续取样的繁琐，缩短了试验时间、简化了操作过程，经过不断发展，应用会越来越广泛。

然而，通过国家水站大数据平台和现场调研得知，在国内以发光细菌法为主的水质生物综合毒性分析仪在水站运行过程中还存在一些问题。一是荷兰TOX-control菌种价格昂贵，运输周期较长，海关开箱安检会造成菌干粉的批次质量不一致，无法保证现场水站持续正常运行，运行率仅14%。二是部分国内厂家仪器使用的是明亮发光杆菌，与弧菌相比，杆菌本身活动性较弱，易发生沉淀，造成光路检测下降，不同批次细菌灵敏度差异较大，重现性差。三是国产费氏弧菌冻干粉的研制大多停留在实验室阶段，稳定性、使用周期尚未达到进口设备要求。要解决这些问题，需要在细菌的质量控制与保证体系上进行大量现场应用研究（研制出可替代进口的费氏弧菌干粉），形成统一标准，保证现场监测数据的准确、可靠，起到真正意义上的水质预警监测作用。

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