朱 姝，吴志鹏，臧广超，王以武，马廉举，刘 倩

(重庆医科大学实验教学管理中心，重庆401331)

0 引言

20世纪中期，日本海滨小镇水俣发生大规模甲基汞中毒事件，对环境及人类健康造成毁灭性影响。自此，重金属汞离子的破坏性影响开始引起全世界的警惕，联合国环境规划署（UNEP）为控制和减少汞的排放通过了“水俣公约”[1-2]。众所周知，汞离子是最具危害性的重金属污染物之一，易从环境转移到食物链中，并在人体累积，对大脑、神经系统、内分泌系统、肾脏等器官造成严重损害[3]。因此，开发高灵敏度、高选择性的汞离子检测方法具有重要意义。

电致化学发光（ECL）是电激发下的一种化学发光（CL）现象。通过将电化学和光谱学的巧妙结合，不仅简化了实验装置，阻断了发光杂质和散射光的背景响应，灵敏度高，还具有较好的特异性、选择性和再现性。因此，ECL技术已经在微量检测、食品与环境检测和成像分析等多领域具有广泛的应用[4]。基于“胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶”（T-Hg2+-T）的稳定结构[5]，研究者们设计了各种类型的针对汞离子的生物传感器[6-9]。汞离子电致化学发光生物传感器是将生物传感技术与电致化学发光相结合，将汞离子浓度转换为电致化学发光信号的一种新型传感器。然而，为了实现汞离子的灵敏检测，信号输出模式成为构建其电致化学发光生物传感器的关键。该文主要以信号输出模式的不同，综述了近几年来基于汞离子电致化学发光生物传感器的相关研究。

1 “signal on”型信号输出模式

早期的研究中，单信号开关模式（以信号的减少或增加来响应分析物的存在）被广泛应用于传感器的构建，它具有灵敏度高、操作简便、过程简单等优点[10-12]。“signal on”型信号输出模式的汞离子电致化学发光生物传感器是一类随着分析物汞离子浓度的增加，ECL信号逐渐增强的传感器类型，是信号在目标物出现前后信号由弱到强的过程，也是最常见的信号输出方式，其在原理上具有检测范围宽、背景信号低等特点[13-16]。基于汞离子极易被富含胸腺嘧啶的核酸捕获的特性，Guangming Nie团队采用核酸夹心法通过金属汞离子直接引入发光物质构建了一个“signal on”型信号输出模式的电致化学发光生物传感器（传感器构建原理如图1所示）[17]。传感器以高导电性的聚（5-甲醛吲哚）/还原氧化石墨烯（P5FIn/erGO）作为基底修饰电极，通过醛基与氨基的共价偶联作用接上富含胸腺嘧啶（T）的DNA单链（DNA S1）。金纳米粒子（AuNP）连接石墨烯量子点（GQDs）-DNA S3和DNA S2作为ECL信号探针。AuNP的存在不仅可以增加GQDs的负载量，还能起到信号放大的作用。通过T-Hg2+-T的配位反应，在目标物Hg2+的存在下信号探针与DNA S1杂交，将其组装到修饰电极上，从而实现了一个“signal on”型信号输出模式。该修饰电极的ECL信号强度与Hg2+的浓度在0.01 nmol/L至100 nmol/L的范围内呈现线性相关性，检测限为2.48 pmol/L，实现Hg2+的灵敏检测。

图1 基于直接引入ECL信号探针DNA S3/AuNP/GQDs生物螯合物的“signal on”型电致化学发光生物传感器的制备原理[17]Fig.1 Schematic diagram of the ECL sensor based on P5FIn/erGO nanocomposite and GQDs[17]Copyright 2019 Elsevier[17]

此外，Tian-Fang Kang团队利用同时引入汞离子结合的电致化学发光共反应物的方式，成功构建了针对汞离子的“signal on”型信号输出模式的电致化学发光生物传感器[18]。如图2所示，实验设计将聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）和带负电荷的CdSe/CdS量子点依次吸附在MoS2的表面形成QD-PDDA-MoS2复合材料，同时将其作为基底固定富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 1），制备修饰电极。金纳米粒子（AuNPs)结合另一种富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 2）和葡萄糖氧化酶（GOD）形成GOD-AuNPs-DNA2偶联物。反应池中同时引入GOD-AuNPs-DNA2偶联物和Hg2+，依赖形成T-Hg2+-T络合物将生成QDs共反应物H2O2的催化剂GOD引入。GOD催化葡萄糖与溶解氧反应生成H2O2，再与QDs作用使ECL信号放大，实现了信号随汞离子的增加而增强。该传感器的ECL信号强度与Hg2+的浓度在1.0×10-6mol/L至1.0×10-12mol/L的范围内呈现线性相关性，检测限为1.0×10-13mol/L，实现了Hg2+的灵敏检测。

图2 基于CdSe/CdS量子点和过氧化氢共反应发光的“signal on”型电致化学发光生物传感器的制备原理图[18]Fig.2 Fabrication process and the determination mechanisms of the electrochemiluminescence sensor[18]Copyright 2019 RSC

2 “signal-off”型信号输出模式

在构建针对汞离子的电致化学发光生物传感器中，另一种比较常用的信号输出模式为“signal-off”型。它是与“signal-on”型相反的信号输出模式，即随着汞离子浓度的不断增加，电致化学发光信号逐渐降低[19-21]。以目标物汞离子作为电致化学发光淬灭剂所构建的传感器便顺势而生[22]。Ruo Yuan团队首次发现汞离子对于乙基异鲁米诺（ABEI）的电致化学发光有淬灭作用[23]。受到这一发现的启发，他们合成了ABEI功能化银纳米颗粒修饰的氧化石墨烯复合纳米材料（GO-AgNPs-ABEI)作为发光物质，并通过氨基与醛基的共价偶联作用连接了具有较强促发光性能的二茂铁标记的ssDNA（Fc-S1)。在H2O2存在下，其作为第一重的信号开关，产生较强的ECL信号。随后，在适配体的作用下，通过杂化链反应将辅助ssDNA(S2)、富含胸腺嘧啶ssDNA(S3)的金纳米颗粒（AuNPs-S2-S3)固定在传感平台上。通过强而稳定的“T-Hg2+-T”配位作用，汞离子被AuNPs-S2-S3捕获，有效地淬灭了ABEI的ECL信号，成功构建了信号“signal-off”的状态。黏蛋白MUC1作为适配体特异性靶点与适配体结合，释放捕获Hg2+的核酸纳米基团，重新开启了信号，达到“on”状态。该生物传感器策略结合Hg2+的猝灭效应降低背景信号，利用目标信号的循环放大，成功地实现了对Hg2+和MUC1的检测，且具有较宽的线性响应范围。Hg2+的浓度在10.0 pmol/L至1.0 mmol/L的范围内呈现线性相关性，检测限为3.1 pmol/L[23](图3)。

图3 基于汞离子对ABEI发光淬灭作用所设计的“signal off”型电致化学发光生物传感器[23]Fig.3 Fabrication of the signal-switchable ECL aptasensor for Hg2+and MUC1[23]Copyright 2016 ACS[23]

Fen Ma团队则另辟蹊径，通过引入目标物汞离子，使得发光物质远离电极表面而造成信号下降，从而构建了“signal-off”型信号输出模式的电致化学发光生物传感器[24]。DNA三向链接（DNATWJ)是一种独特的分支结构，由三个连接在接点处的双螺旋臂组成。靶向反应性DNA-TWJ是将反应性结构域作为形成连接的三条臂之一进行连接，结合后的构象变化会导致连接臂彼此之间重新定向。传感器利用将发光探针钌配合物（Ru）标记的Hg2+特异性DNA-TWJ共价偶联到经4-氨基苯甲酸共价修饰的玻碳电极表面，达到ECL信号“on”的状态。在Hg2+存在下，Hg2+与TW/Ru-J1结合后，TW/Ru-J1的构象发生变化，导致发光探针Ru远离电极表面，从而降低ECL信号，达到“off”状态。该生物传感器在0.1 pmol/L至10 pmol/L范围内，随着Hg2+浓度的增加，信号下降并呈线性相关，检测限为0.04 pmol/L（图4）。

图4 基于靶触发DNA三向链接所构建针对汞离子的电化学发光生物传感器[24]Fig.4 Schematic diagram of the fabrication of DNA-TWJbased ECL biosensor for the detection of Hg2+[24]Copyright 2019 Elsevier

3 “signal on-off-on”型信号输出模式

汞离子的电致化学发光生物传感器“on-offon”型信号输出模式具体来说包含三个步骤：第一步是初始的“signal on”状态的构建，需要较强的ECL信号响应；第二步是引入灵敏的信号淬灭剂达到“signal-off”状态；第三步“on”，即通过目标物汞离子的引入来消除淬灭剂的影响来实现[25-26]。与单独的“signal on”和“siganl off”信号输出模式相比，这种信号输出策略不仅具有低背景信号和高灵敏度，而且还增强了分析检测的特异性[27-28]。如图5所示，Nian Hong团队基于分子识别技术，研制了针对汞离子的“on-off-on”型信号输出模式的电致化学发光生物传感器[29-31]。传感器通过将发光探针三联吡啶钌（Ru(bpy)32+)、环糊精金纳米粒子（CD-AuNPs)和Nafion复合材料修饰在玻碳电极（GCE）表面作为ECL基底获得强的ECL信号。再依据分子识别策略将一端带有二茂铁的单发夹式DNA探针（Fc-Probe-DNA）通过超分子识别作用链接CD，获得“off”信号。实验证表明，在没有Hg2+的情况下，探针保持着单一的发夹节后，因Fc作用导致Ru(bpy)32+的ECL淬灭；而在Hg2+存在下，探针更倾向于形成T-Hg2+-T络合物，使Ru（bpy）32+的ECL信号明显恢复，为Hg2+检测提供了传感平台。

图5 基于信号淬灭的“on-off-on”型信开关模式的汞离子电致化学发光生物传感器制备[29]Fig.5 Schematic diagram of the fabrication process of ECL-biosensor for the determination of Hg(II)[29]Copyright 2017 Elsevier

随着ECL研究的不断进步，能量共振转移的淬灭信号作用为ECL生物传感器设计带来了新的契机[29-31]。Jian-Ding Qiu团队利用g-C3N4和DNA-Ag NCs的能量共振转移设计了“on-off”的ECL信号输出，借助Hg2+与DNA的T-Hg2+-T作用减弱能量转移使信号“on”，获得较灵敏的汞离子ECL生物传感器[29-31]。Abdollah Salimi团队则是利用CdTe@CdSQDs与金纳米粒子的能量共振转移设计了信号“on-off-on”输出模式的汞离子电致化学发光传感器，检测线低至2 amol/L[29-31]（图6）。

图6 基于能量共振转移的“on-off-on”型信开关模式的汞离子电致化学发光生物传感器制备[31]Fig.6 Schematic representation of the ECL biosensor for Hg2+detection[31]Copyright 2018 Elsevier

4 比率型信号输出模式

汞离子的电致化学发光传感器信号的“开关”输出模式主要是基于发光体ECL发射强度的变化。在检测过程中由于某些环境变化，如非目标诱导试剂降解、共反应物浓度、pH值、浓度等影响发光效率，容易出现假阳性误差。为了提高传感器的准确性，近年来，研究者们提出了比率型ECL传感器，其量化结果取决于两个发光强度的比值变化而不是绝对值，通过自校准从而提供更精确的测量结果[32]。发光体三联吡啶钌（Ru（bpy)32+）与含氮纳米材料的共发光的特性为ECL比率型传感器的发展提供了契机[33-34]。Ru-Ping Liang团队基于Au-g-C3N4NSs和Ru(bpy)32+双电位电致化学发光的特性建立了一种简单、灵敏、选择性好的比率型ECL传感器[35]（图7）。

图7 汞离子电致化学发光比率型传感体系构建原理图[35]Fig.7 Ratiometric ECL method for Hg2+monitoring just using Ru(bpy)32+as emitter and Au-g-C3N4NSs as onelectrode coreactant[35]Copyright 2020 RSC

5 总结和展望

电致化学发光在理论和实际应用方面的迅速发展，有力地证明了其是超灵敏测定重金属离子的一种重要途径。而基于Hg2+自身与胸腺嘧啶的配位特性，针对Hg2+所构建的电致化学发光生物传感器则顺势而生。该文根据不同的开关模式，回顾了ECL检测Hg2+的原理、优点和应用。这些成果扩展了电致化学发光检测Hg2+的检测策略，推动了针对Hg2+的高通量和便捷式电致化学发光检测。而随着电致化学发光分析技术的发展，构建比率型电致化学发光传感器以及如何结合化学研究领域中的新发现将成为未来的研究热点及方向。

致谢：

本项目得到了重庆医科大学实验教学管理中心创新人才促进计划（LTMC201903）和重庆医科大学大学生科学研究和创新实验项目（SRIEP201966）资助。