李志国， 杨先照， 李小科， 马 浔， 王 姗， 张 梅， 叶永安

1 北京中医药大学东直门医院 a.消化科； b.检验科， 北京 100700； 2 北京中医药大学 肝病研究所， 北京 100700； 3 北京杏园金方国医医院， 北京 101300

1 肝脏分区与氧气的关系

氧气对所有活细胞至关重要，其在体内的运输受到组织或器官代谢需求和功能状态的调节[1]。肝脏独特的解剖结构，影响其生理功能和氧气稳态[2]：肝脏分别通过肝动脉和肝门静脉接受高氧血液和乏氧血液。在肝脏中，从门静脉和肝动脉到中心静脉的单向血流(即门静脉区60～65 mm Hg，中央静脉周围区域30～35 mm Hg)在肝脏实质内形成氧梯度[3]。

肝脏的基本结构单位是肝腺泡。依据氧张力的不同形成3个不同代谢能力和酶含量的区域(门静脉周围区域糖异生能力更强，而中央静脉周围区域糖酵解能力更强)[4]，从而将肝腺泡分为3个功能带：近汇管区为Ⅰ带，此区域肝细胞最先获得新鲜血源，代谢活跃，再生能力强；近中央静脉周围区域为Ⅲ带，此区域肝细胞营养较差，对有害物质的抵抗力低，再生能力弱；位于二者之间的为Ⅱ带，此区域肝细胞的营养、代谢及再生能力均介于前两者之间。不同肝腺泡区域的结构、功能不同，中央静脉周围区域比门静脉周围区域(汇管区)更易受到极度缺氧的影响[3]。

肝细胞在不同氧张力下的生理暴露影响其对缺氧应激的能力。在接近门静脉周围氧张力条件下培养的原代大鼠肝细胞较在接近中央静脉周围氧张力条件下存活时间长[5]。表明在缺氧的情况下(如肝代谢需求增加、组织缺血等)，当氧张力低于阈值时，中央静脉周围的肝细胞可能会受到更大的损伤[6]。

2 肝病的缺氧微环境

缺氧微环境是在致病因素作用下，组织细胞局部因炎症损伤等引起缺氧而形成。肝损伤引起的血管紊乱和微环境缺氧，在发病早期已经开始。缺氧是急慢性肝病重要的微环境特征，也是导致肝损伤及炎症发生的重要因素[4]。低氧不仅是细胞损伤和炎症的促进因素[7]，亦是肝再生的抑制剂、血管生成和纤维生成的主要刺激物以及肝癌的启动因素。目前发现最重要的缺氧应激因子是缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，缺氧的许多效应均由HIF-1α介导[4]。

2.1 肝损伤与缺氧微环境 “常氧”和“缺氧”取决于器官适应的正常氧张力，尽管在健康肝脏中存在氧张力的变化，但未观察到缺氧反应[8]。然而，肝脏的特殊结构和肝细胞的高代谢需求使其易受缺氧影响，在病毒性肝炎、脂肪性肝炎、肝纤维化(肝硬化)和肝癌等肝脏受损及继发炎症时，均伴有缺氧现象[6,9-10]。例如肝病时出现的肝细胞肿胀、肝血管收缩、肝窦狭窄，肝窦毛细血管化，肝窦间隙胶原纤维沉积，乃至肝细胞再生结节和纤维间隔形成，肝内血管网异常，以及由于肝功能受损、肠源性内毒素促使内皮素增多等均可导致或加重肝内缺氧，形成肝脏缺氧微环境，而使微环境缺氧贯穿于肝病发生发展的始终。

2.2 肝纤维化/肝硬化与缺氧微环境 慢性肝损伤引起缺氧和肝纤维化。肝星状细胞(HSC)在纤维化的发生发展中起关键作用[11]。在由酒精、肝炎病毒、遗传性疾病等引起的慢性肝损伤期间，细胞因子刺激HSC活化为肌成纤维细胞，并刺激其增殖和产生胶原，这是导致肝纤维化发生的关键步骤[12]。慢性肝损伤期间的缺氧微环境可能是HSC活化的重要刺激因素[13]。缺氧刺激HSC释放多种介质，这些介质影响纤维化的进展，例如HSC在缺氧条件下合成并释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素-1[14-15]。血管生成促进肝纤维化，而HSC促进血管生成介质的产生，因此血管生成和肝纤维化是相互促进的[16]。

在肝纤维化过程中伴随的肝脏缺氧通过HIF-1上调HSC与肝窦内皮细胞中的VEGF和血管生成素等基因表达，诱导肝窦内皮细胞向毛细血管内皮转化[17]，导致肝窦表面的筛孔数量明显减少甚至消失，这种肝内结构的异常改变将促进肝纤维化进展，导致肝内血管阻力增加、门静脉高压形成[4]。

肝硬化时肝细胞缺氧除由肝内动静脉分流、肝窦减少和肝窦毛细血管化[18]所致外，还受HSC在肝血窦管腔密度增大和覆盖增多、血管收缩因子过多[19-20]等影响。HSC具有收缩特性，其可引起肝窦血管收缩，入肝血流减少而加重缺氧。此外，缺氧及HIF-1上调内皮素-1、内皮素-1受体及内皮素-B受体引起的血管收缩进一步加剧微环境缺氧[4]。

2.3 肝细胞癌(HCC)的缺氧微环境 HCC组织细胞生长所处的氧分压较正常肝组织低[21]，这种缺氧环境不仅对HCC的发生发展十分重要，而且在诱导HCC细胞耐药、血管形成等多个方面发挥重要作用。HCC与其他实体肿瘤类似，都具有缺氧的特征，特别是在血管生成不能满足肿瘤快速生长的代谢需求时[22]。一方面，缺氧诱导肿瘤坏死，限制HCC细胞增殖；另一方面，缺氧导致HCC细胞开启缺氧反应，诱导血管生成以及肿瘤侵袭和转移。肝硬化基础上发生的HCC同时具有肝硬化的缺氧微环境特征。

为了适应缺氧微环境，肿瘤的新陈代谢方式会发生相应改变，正常组织主要通过有氧呼吸获得能量，而肿瘤细胞的能量主要来自无氧糖酵解，即使氧含量正常，肿瘤细胞也主要依赖无氧糖酵解获取能量，这一现象称为Warburg效应。在缺氧状态下，HCC细胞可以选择糖酵解等机制获取能量并继续增殖[23]。从氧化磷酸化向无氧糖酵解的转变是肿瘤细胞能够在缺氧微环境中存活的重要前提，在此过程中HIF-1α起到至关重要的作用。HIF-1α能够直接激活乳酸脱氢酶A(LDHA)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK-1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)和葡萄糖载体蛋白1(GLUT-1)等基因，这些基因编码的葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶是肿瘤细胞无氧糖酵解所需。目前研究已证明PKM2[24]、GLUT-1[25]是肿瘤细胞Warburg效应的重要调控因子。

3 HIF的结构及调节

3.1 HIF的结构及分类 为了适应环境中不同氧气水平，生物体开发出氧气传感系统，触发适应性转录以维持稳态。在缺氧条件下，HIF转录活性增强导致参与细胞功能的各种基因表达增强，从而促进体内细胞代谢、增殖和迁移。目前有3种已知的HIF转录因子：HIF-1、HIF-2和HIF-3，它们是由HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α与HIF-1β亚单位组成的3种异二聚体复合物[8,26]。HIF-1β又被称为芳香烃受体核转运蛋白，在细胞核内表达不受氧浓度影响，其主要作用是维持HIF的结构稳定[27]。α亚单位通过氧诱导的蛋白降解进行调节，HIF-1α与HIF-2α亚基均受氧气浓度影响，缺氧可诱导其高表达。

HIF中最重要的转录因子是由HIF-1α及HIF-1β组成的HIF-1，其广泛表达于机体各组织及细胞，参与哺乳动物细胞中氧平衡调节[28]。HIF-1适应细胞和组织中的低氧会导致一系列与血管生成(主要是VEGF)、红细胞生成、葡萄糖摄取及代谢、细胞增殖和生存有关的基因的转录诱导[26,29]。

3.2 HIF的氧依赖性调节 细胞通过协调转录反应来适应低氧，这一反应由HIF调节[30]。HIF通过结合靶基因中被称为低氧反应元件的特异性DNA序列来调节信号传导事件，导致其转录增加或减少[27]。尽管HIF转录因子在缺氧条件下稳定，但在“正常”氧分压下，靶向脯氨酰残基被脯氨酰羟化酶结构域包含蛋白(PHD)羟基化后，羟基化的HIF-α与von Hippel-Lindau(VHL)相互作用，激活泛素酶系统，导致HIF-1α亚单位迅速降解，故正常氧浓度情况下HIF-1α表达较低[31-32]。在缺氧条件下，PHD活性降低，导致HIF-1α亚单位稳定表达，并通过N末端和C末端激活域与其调节元件[31]结合，进而形成转录激活复合物。

另一种氧敏感性羟化酶，即缺氧诱导因子抑制因子(factor inhibiting HIF，FIH)，亦调节HIF-1α的表达。FIH可使HIF-1α的C末端反式激活结构域中天冬酰胺酰残基羟基化，但不抑制异二聚体HIF-1α与其转录共激活因子的结合[33]。FIH限制HIF-1α的C末端反式激活结构域的活性，但不限制N末端结构域的活性，这对于缺氧反式激活的基因具有重要意义，因这一特征，细胞可以表现出双相HIF-1α依赖性转录特征：在中度缺氧下为PHD失活型，在严重缺氧下为PHD和FIH共同失活型[34]。

3.3 HIF的非氧依赖性调节 除了缺氧之外，HIF-1α还可以通过其他介质被激活，包括细胞因子、生长因子和氧化应激[35]。细胞表面受体，例如G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶促进HIF-1α mRNA 翻译和反式激活活性[8]。Luo等[36]发现了PKM2的新作用，该酶催化糖酵解的最后一步，并作为HIF-1α和HIF-2α的共激活因子。有研究[37]显示在肝癌异种移植动物模型中，PI3K抑制剂可阻断HIF-1α，表明HIF-1α的激活受PI3K/Akt通路调控。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞生长和增殖的整体调节剂，其可通过细胞翻译和转录的特异性激活来调节HIF表达，许多报道[38-39]显示细胞通过PI3K/AKT/mTOR途径进行HIF相关的调节。

4 HIF与肝病的关系

4.1 HIF与肝损伤 肝损伤引起微环境缺氧，而缺氧进一步加重肝损伤及炎症，HIF在其中发挥重要作用。Morello等[40]证明HIF-2α通过触发肝细胞释放富组氨酸的糖蛋白驱动非酒精性脂肪性肝炎。细胞实验[41]发现黄酮类化合物千层纸素A可通过抑制HIF-1α改善乙醇诱导的肝脂肪变性和炎症。新近研究[42]表明，缺氧微环境中癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞(肿瘤内的主要促炎细胞)之间的HIF-1α/IL-1β信号传导环，促进癌细胞上皮-间质转化和转移。这些研究探讨了缺氧及HIF与肝脏炎症损伤，以及炎症与肝癌的关系，为肝炎的治疗提供了新的契机。

4.2 HIF与肝纤维化 肝纤维化是所有慢性肝病的共同途径，肝纤维化持续进展，最终导致肝硬化。肝纤维化的形成伴随着胶原和细胞外基质(ECM)的积累。肝脏中的HSC在肝纤维化发展中起关键作用[11]。活化的HSC和肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)迁移促进了肝纤维化的进展[43]。HIF-1α调节缺氧时HSC的活化，这对于胶原沉积和血管生成尤为重要[44-45]。HIF-1α在肝纤维化发展中的作用已在HIF-1α基因敲除小鼠的实验中明确鉴定[44]，表明缺氧和HIF-1α募集先于纤维化发生，HIF-1α的肝细胞特异性沉默导致ECM沉积显著减少。在从手术标本切片分离的人HSC中，通过缺氧激活HIF-1α，证明HIF-1α是刺激HSC和MF迁移的启动因素；HIF-1α的有效沉默导致HSC和MF迁移显著抑制，表明HIF-1α在人肝纤维化的发展中具有不可或缺的作用[46]。近期动物实验[47]表明，异氯酸B通过microRNA-122/HIF-1α信号通路抑制多种促纤维化因子，对非酒精性脂肪性肝炎相关的肝纤维化具有显著的保护作用。

4.3 HIF与肝癌前病变 HIF-1α和HIF-2α活化与肝细胞恶性转化存在明显联系。由于肝硬化为HCC的高危因素，因此确定HIF是否是肝硬化进展为癌症的驱动力具有重要意义。对肝细胞发生恶性转化的动态观察发现，在肝细胞发生变性阶段，HIF-1α mRNA转录增加和HIF-1α过表达，在肝细胞发生变性、癌前病变和癌变的不同发展阶段，HIF-1α基因及蛋白呈动态进行性表达，且血清HIF-1α表达情况与肝组织平行，整个过程中HIF-1α基因序列与GenBank源序列一致。有研究[48]表明，肝细胞恶性转化过程中HIF-1α mRNA转录和HIF-1α蛋白表达在癌前病变和HCC形成阶段达到高峰。

4.4 HIF与HCC 缺氧驱动的血管生成是组织再生、炎症和肿瘤生长的突出特征，HIF-1和HIF-2对低氧诱导的血管生成有重要影响[29]。作为低氧反应的主要介质之一，HIF-1是激活缺氧反应的基因，该基因参与肿瘤发生和癌症进展的多个方面，包括增殖、代谢、血管生成、侵袭、转移和耐药[22]。HCC微环境中高水平的HIF-1导致HCC细胞的增殖和存活能力增强，HIF-1过表达与HCC的不良预后相关[22]。有研究[49]证实，HIF1α通过增加HCC细胞中的SNAI1转录促进上皮-间质转化。临床HCC组织研究[50]证实HIF-1α和赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyloxidase-like 2，LOXL2)呈正相关，HIF-1α和LOXL2的高表达与血管生成拟态的形成及不良预后有关，并发现HIF-1α通过调节LOXL2诱导上皮-间质转化，HCC细胞迁移、侵袭和血管生成拟态形成。

此外，HIF与抗肿瘤治疗中出现的耐药相关[51]。HIF的高表达与HCC靶向药物索拉非尼耐药现象之间存在关联，目前索拉非尼治疗与HIF抑制剂的组合已被证明是在体外和体内克服索拉非尼耐药的方法[52]。近期研究[53]表明，肝癌缺氧微环境中HIF-1α诱导的髓样细胞-1(TREM-1)阳性肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)启动肿瘤免疫抑制，是造成肝癌抗程序性死亡配体-1治疗抵抗的主要原因。

5 小结

缺氧微环境是肝病的一种普遍现象，贯穿于肝病发生发展的始终。HIF是目前发现的最重要的缺氧应激因子，与肝细胞的炎症损伤、纤维化的形成、肝细胞的恶性转化密切相关，并在肝癌发生阶段起重要作用。针对肝病各个阶段亟需新药物的开发，当前有关HIF作用机制的研究为肝病各阶段的治疗提供了新策略。但需要进一步明确缺氧与肝病进展的确切机制，以及深入研究缺氧微环境与炎症和免疫等方面的关系。以期通过干预或调节缺氧微环境或其中的某一或某些靶点来改善肝脏疾病。