张 雯,林毅侃,谢佳雨,欧 杰,3,4,*,李柏林

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海市质量监督检验技术研究院/国家食品质量监督检验中心(上海),上海 200233;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;4.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,上海 201306)

苯乳酸(Phenyllactic Acid,PLA)是一种小分子化合物,抑菌谱广,溶解性好,易在食物系统中扩散,在较宽pH范围内能够保持稳定[1]。苯乳酸能够存在于新西兰麦卢卡蜂蜜[2-3]、泡菜[4]和发酵面团[5],对人体无毒无害。因此,苯乳酸有望开发成为一种新型食品抑菌剂。

苯乳酸能抑制某些革兰氏阴性菌[6]、革兰氏阳性菌[7-8]、真菌[9]和真菌毒素[10]。苯乳酸能够通过影响微生物细胞膜从而抑制微生物的生长繁殖[11-12],有研究表明在超高温瞬时灭菌乳中添加1 mg/mL的苯乳酸可以显著抑制单增李斯特菌的生长[2]。乳酸菌由于一般公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS),其合成苯乳酸的能力已被广泛研究[13-14]。有研究在中式泡菜[4]和韩国泡菜[15]中分离到能够合成苯乳酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。有研究报道利用重组大肠杆菌合成苯乳酸[16],但乳酸菌合成苯乳酸更具有安全性,更能节省食品工业成本。

目前乳酸菌发酵液中苯乳酸的检测方法主要有HPLC法[17-18]、超高效液相色谱-串联质谱法[15](Ultra-High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)、HPLC-MS/M法[3]、薄层层析法[19]和气相色谱法[20]。气相色谱法检测准确能够满足检测需要,但发酵液需冻干后酯化,前处理复杂,样品数量较大时,检测效率不高;UPLC-MS/MS法和HPLC-MS/MS法设备昂贵,成本较高,检测时间长;HPLC法由于前处理简单,准确度高,应用较为广泛。有研究对比了HPLC法检测乳酸菌发酵液中苯乳酸0.22 μm微滤后进样和微滤后过SPE柱对苯乳酸检测的影响,发现微滤后直接进样回收率更好[17]。

目前对可以用于HPLC法测定乳酸菌中的苯乳酸流动相和固定相各不相同,针对使用的流动相和固定相进行的讨论较少。选择合适的流动相和固定相可以提高检测效率,对检测方法进行方法学和不确定度评价,能够衡量检测结果的可信度。本实验旨在选择较为合适的固定相和流动相的组合,并对方法进行评价、计算不确定度,为乳酸菌合成苯乳酸的相关研究及检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

短乳杆菌P3(LactobacillusbrevisP3) 分离自泡菜,由实验室-80 ℃保存;植物乳杆菌ATCC014(L.plantarumATCC8014)中国普通微生物菌种保藏管理中心;苯乳酸标准品 纯度≥98%,上海子起生物科技有限公司;乙腈、甲醇、TFA 色谱级,美国Fisher公司;MRS液体培养基 美国BD公司。

Agilent-1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;恒温水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司;超声波水浴锅 江苏盛蓝仪器制造有限公司;雷磁PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液制备 准确称取苯乳酸0.01 g定容于10 mL容量瓶中,得到浓度为100 mg/L标准储备液,4 ℃避光存放。

取适量储备液,用基质空白液稀释成浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mg/L的标准工作液进行HPLC分析。

1.2.2 发酵液样品前处理 将L.brevisP3和L.plantarumATCC8014以1%接种量分别接种于MRS液体培养基,35 ℃下分别培养120 h。分别取两种菌株的发酵液10000 r/min下离心2～5 min,取上清液0.22 μm微滤后进样。

1.2.3 高效液相色谱测定条件的优化

1.2.3.1 不同固定相对苯乳酸高效液相色谱的影响 本实验测试了三种固定相,分别是:I:AgilentZorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),无封端色谱柱;II:AgilentEclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),双封端色谱柱;III:Agilent Zorbax SB-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

流动相为0.05%TFA-乙腈,体积比为75∶25,流速1 mL/min,检测波长210 nm,进样量10 μL,柱温30 ℃。

1.2.3.2 不同流动相对苯乳酸高效液相色谱的影响 以0.05% TFA为水相,1.2.3.1中得出的较优色谱柱为固定相,考察乙腈和甲醇对苯乳酸HPLC检测的影响,平衡30 min后,进样3次。

以乙腈为有机相,考察0.05% TFA水溶液、0.10%甲酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.02 mol/L乙酸铵溶液、0.05 mol/L乙酸铵溶液、0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4溶液为水相对苯乳酸的HPLC检测的影响,测试不同的水相对苯乳酸的保留能力和对峰型的影响。每种流动相组合试验3种体积比:15∶85、20∶80和25∶75,每种流动相比例下,平衡30 min后,进样3次。

1.2.4 方法学评价

1.2.4.1 线性关系、检出限和定量限的测定 通过HPLC分析6种浓度(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0和5.0 mg/L)的标准品溶液,绘制苯乳酸的校准曲线,使用Aglient1260离线软件计算线性回归,以标准品浓度为x轴,以峰面积为y轴,计算回归方程和系数。

检出限定义为信噪比(Signal-Noise Ratio,RSN)为3时对应的质量浓度,定量限定义为RSN为10时对应的质量浓度。在1.2.3得到的色谱条件下,仪器平衡1 h后,仪器的基线噪声为0.27 mAu。

1.2.4.2 精密度和准确性的测定 精密度试验取2.0 mg/L标准溶液,在1.2.3得到的色谱条件下,在1和30 d分别连续进样6次,测定并计算峰面积平均值和RSD。

重复性试验制备6份2.0 mg/L标准溶液,在1和30 d分别进样,测定并计算峰面积平均值和RSD。

1.2.4.3 回收率实验 取L.brevisP3发酵液适当稀释后10000 r/min离心2 min,取上清液经过适当稀释后得到供试品,0.22 μm微滤后进样,得到发酵液中苯乳酸含量。

向供试品中分别加入低、中、高3个不同水平的的标准品(即加入折合质量为0.2、0.4和1.0 mg/L的苯乳酸标准品),按照1.2.3得到的色谱条件进行HPLC分析考察方法的回收率。

1.2.4.4 稳定性的测定 分别于1、10、20和30 d测定2.0 mg/L标准溶液的峰面积,并计算平均值和RSD。

1.2.5 方法的不确定度 由于样品为直接测定,不确定度的来源有配制标准溶液引入的不确定度、标准曲线引入的不确定度、重复性引入的不确定度,加标回收引入的不确定度,根据以上不确定度来源计算扩展不确定度。

1.2.5.1 配制标准溶液引入的不确定度(ustandard) 配制标准溶液的不确定度主要来自标准品(ustock)和标准溶液的配制(upreparation)。仪器的膨胀系数为2.1×10-4,温度变化范围为±4 ℃,10 mL容量瓶检定证书偏差为10±0.02 mL,近似于矩阵分布,由定容体积引起的不确定度ur(V1)=0.00125。1 mL移液管检定证书偏差为1±0.01 mL,近似于矩阵分布,由移液引起的不确定度ur(V2)=0.00579[21-22]。

式(1)

式(2)

式(3)

式中,p%:标准品纯度。

1.2.5.2 标准曲线引入的不确定度(ucalibration) 标准曲线为y=ax+b,a为斜率,b为截距。

式(4)

式(5)

1.2.5.3 重复性引入的不确定度(urep)

式(6)

式中,Srep-重复性实验标准差,x0-重复性实验中所用标准溶液浓度,n-标准溶液测定重复数。

1.2.5.4 回收率引入的不确定度(urecovery)

式(7)

通过显著性确定平均回收率是否与1有显著性差异。检测统计数据t通过下式计算:

式(8)

t与95%置信度,n-1自由度的双边临界值tcrit比较(其中n是用来评估回收率平均值的测试结果的数目),假如t大于或等于tcrit值,则ˉrec与1有显著性差异,urecovery不计入合成不确定度,反之则计入合成不确定度,tcrit≈2.306。

1.2.5.5 相对合成不确定高度和扩展不确定度 根据不确定度的传播定律,相对合成不确定度为:

式(9)

当置信水平P=95%(k=2),相对扩展不确定度:

U=kc×urel

式(10)

1.3 数据处理

实验中每组平行重复6次,用Origin 2018作图,Agilent 1260离线软件和Microsoft Excel 365进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件的优化

2.1.1 不同固定相对苯乳酸高效液相色谱的影响 本实验采用RP-HPLC法,分别测试了三种色谱柱对苯乳酸的分离效果,分别是未封端C18色谱柱(Ⅰ)、封端C18色谱柱(Ⅱ)和C8色谱柱(Ⅲ)。色谱条件参照1.2.3.1。

色谱柱Ⅰ(图1a)和色谱柱Ⅱ(图1b)均能够在5.9 min平稳出峰,色谱柱I有轻微拖尾现象,色谱柱Ⅲ(图1c)拖尾现象严重,色谱柱Ⅱ相比色谱柱Ⅰ和Ⅲ峰型较好。根据色谱柱使用说明,C18和C8色谱柱适用pH范围为2.0～9.0。经测定,乳酸菌发酵液的最低pH为3.7,能够满足色谱柱的适用pH范围。色谱柱II出峰平稳,无拖尾,峰型对称,更适宜苯乳酸的HPLC检测。

图1 不同固定相对苯乳酸HPLC分析的影响

2.1.2 不同流动相对苯乳酸高效液相色谱的影响 流动相的优化以双封端C18色谱柱为固定相,首先以0.05% TFA为水相,考察了甲醇作为有机相在双封端的C18柱上对苯乳酸的洗脱能力。如图2a所示,以甲醇为有机相,在峰后出现了轻微拖尾现象。乙腈比甲醇具有更强的洗脱能力,以乙腈作为流动相峰型较好,有机相使用的比例小。因此,使用乙腈(图1b)作为有机相洗脱苯乳酸较好。

图2 不同溶剂系统对苯乳酸HPLC分析的影响

其次考察了不同水相对苯乳酸HPLC检测的影响。图2b表明,0.10%磷酸水溶液-乙腈为流动相,对苯乳酸的保留能力差。以0.02 mol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相时(图2c),峰前出现小峰,且峰形不佳。流动相为0.05 mol/L乙酸铵溶液-乙腈时,保留能力弱,出现了峰型分裂(图2d)。在以0.10%甲酸溶液-乙腈为流动相的条件下,在85∶15 (v/v)和80∶20 (v/v)(图2e,f),不同流动相比例下,峰形存在分裂和小峰的现象和前尾峰的现象,在75∶25 (v/v)下有轻微拖尾现象(图2g)。0.02 mol/L KH2PO4溶液-乙腈(图2h)和0.02 mol/L K2HPO4溶液-乙腈(图2i)峰型有拖尾现象。综上,0.05%TFA水溶液-乙腈为流动相时峰型更佳(图1b)。

表1 线性回归方程、检出限和定量限

表2 仪器精密度和重复性实验

2.2 方法学评价

2.2.1 线性范围、检出限及定量限 以2.1得出的色谱条件进行方法学评价,线性范围、检出限及定量限结果见表1,回归方程y=32.5x+1.04且r>0.990,该方法在0.2～5.0 mg/L内有良好的线性。使用0.2 mg/L的标准溶液测定检出限和定量限,分别为0.1400和0.4600 mg/L,表明该方法灵敏度高,能够满足检测需要。

2.2.2 仪器精密度和重复性实验 表2为仪器精密度和重复性,苯乳酸标准溶液在1 d精密度和重复性测试RSD分别为0.30%和0.64%,在30 d精密度和重复性测试RSD分别为0.59%和0.79%。结果表明,仪器精密度良好,方法具有良好的重现性。

2.2.3 回收率实验 表3为回收率实验结果,L.brevisP3发酵液稀释后中苯乳酸浓度为0.14 mg/L,加标回收率在99.88%～101.08%,在80%～110%之间[23],回收率较好,能够满足检测需要。

表3 回收率实验

2.2.4 稳定性实验 对30 d内该苯乳酸标准储备液稳定性进行了测试,如表4所示,在30 d内峰面积为69.73 mAu,且RSD为2.45%,4次稳定性测试结果差异不显著(P>0.05),峰面积测定结果稳定,结果表明,标准储备液在30 d内4 ℃保存下性质稳定。

表4 苯乳酸标准储备液稳定性

2.3 不确定度评价

实验操作中不可避免的产生不确定度,不确定度能够反映结果的可靠性,本实验计算了L.brevisP3发酵液中苯乳酸测定的扩展不确定度,其中包括标准溶液的配制,标准曲线、重复性和回收率。回收率不确定度为0.0014,t大于tcrit值,回收率不计入相对不确定度。

标准溶液配制的不确定度为0.013,标准曲线的不确定度为0.0098,重复性的不确定度为0.0015,扩展不确定度为0.0046。在不确定度来源中,标准溶液稀释和校准的不确定度是整体不确定度中重要的来源。重复性引入的不确定度最小,因此在配制标准溶液和建立标准曲线时应引起重视。L.brevisP3发酵液中苯乳酸测定结果为(0.1400±0.0046) mg/L。

2.4 乳酸菌发酵液中苯乳酸的测定

本实验取L.brevisP3和L.plantarumATCC8014发酵液检测其中苯乳酸的含量。取灭菌后的MRS液体培养基测定空白样品,检测发现MRS液体培养基含有苯乳酸,含量为5.58 mg/L。乳酸菌发酵液中苯乳酸含量为测定值减空白样品中苯乳酸含量。

如图3所示,L.plantarumATCC8014和L.brevisP3均能够合成苯乳酸,在培养120 h后苯乳酸合成量分别为77.58和62.60 mg/L。利用本方法,苯乳酸在6.00 min出峰,目标峰与杂质峰分离彻底,出峰时间适宜,检测成本低,有机相使用比例小,环境友好。本方法可根据待测物质中苯乳酸的含量调整标准曲线的线性范围。

图3 乳酸菌发酵液中苯乳酸HPLC图谱

3 讨论

C18和C8表示通过固定相键合至二氧化硅的烷烃分别为18或8个碳。碳链的增加也增加了键合相的非极性区域,能够影响保留和选择性[24]。C18的碳链比C8长,因此具有更好的保留性能。C8色谱柱适用于大分子的分离,而苯乳酸是小分子物质,C18色谱柱可以更好地满足检测需求[24]。色谱柱封端主要用于反相色谱中。封端色谱柱由于覆盖了更多的硅烷醇基,可以消除或减少可能发生的副反应,减少拖尾并延长色谱柱的寿命。由于发酵液和水相流动相为酸性,使用色谱柱II可以减少色谱柱堵塞的可能性,从而延长色谱柱的使用寿命。故选择封端C18色谱柱为佳。

采用酸性的水相流动相能够改善峰型,苯乳酸为小分子有机酸,采用酸性的流动相也能够抑制待测物质解离[25-27]。水相流动相使用前测定pH,保证pH>2,防止酸性过大时容易对色谱柱造成损伤。TFA的最大吸收波长小于200 nm,苯乳酸的检测波长为210 nm,检测干扰小。由于苯乳酸RP-HPLC中的保留值较小,测定时一般采用极性大的流动相,当酸性流动相比例高时,酸性物质容易被电离,导致出现小峰,故苯乳酸在0.1%甲酸-乙腈和乙酸铵-乙腈下出现小峰和峰型分裂[26]。0.1%甲酸水溶液、0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4和乙腈在75∶25 (v/v)下轻微拖尾,峰高一致,不影响定性定量,但当样品中杂质过多时,容易造成苯乳酸目标峰和杂质峰分离不开,检测结果误差大,故选择0.05%TFA-乙腈为流动相,峰型对称,半峰宽小,定性定量更加准确。

目前苯乳酸的HPLC检测多采用梯度洗脱,梯度洗脱可用于一次分离多种物质,当分离物质只有一种时,梯度洗脱容易造成基线不稳,影响定型和定量,且梯度洗脱所需要的平衡时间长,采用等度洗脱的方法,平衡所需的时间短,也就缩短了测定所需时间,随着色谱柱平衡时间的减少和有机试剂的使用减少,节省了检测成本,对环境友好,不仅能够应用于实验室内苯乳酸含量的测定,还能够用于大批量样品的测定。利用本方法检测乳酸菌发酵液中的苯乳酸,出峰稳定,目标峰与杂质峰分离程度好,操作简单,定性定量准确。

李兴峰等[28-29]从家庭中式泡菜中分离出能够合成苯乳酸的L.plantarum和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei),市售泡菜中没有分离到乳酸菌。L.brevisP3分离自市售中式泡菜,具有吸附重金属Cr3+的能力[30]。L.brevisP3不仅能够吸附重金属,还具有合成苯乳酸的能力,对重金属吸附和苯乳酸合成的综合性研究,具有一定的参考性价值,L.plantarumATCC8014能够在120 h内合成77.58 mg/L苯乳酸,可在后续的研究中对其苯乳酸合成能力进行优化。

4 结论

本实验对一种RP-HPLC检测乳酸菌发酵液中苯乳酸的方法从流动相和固定相进行了优化,对能够用于苯乳酸检测的流动相和固定相进行了测试和评价,确定了使用封端C18色谱柱,0.05%TFA:乙腈,体积比为75∶25的等度洗脱的洗脱系统,检出限和定量限分别为0.1400和0.4600 mg/L,仪器精密度良好,回收率(99.88%～101.08%)较高,方法重复性能够满足检测需要,操作简单,结果准确,可以用于检测发酵液中苯乳酸,发现了两株能够合成苯乳酸的乳酸菌,L.plantarumATCC8014和L.brevisP3均能够合成苯乳酸,在培养120 h后苯乳酸合成量分别为77.58和62.60 mg/L,为乳酸菌合成苯乳酸的相关研究提供参考,后续研究中可对两株乳酸菌菌合成苯乳酸能力进一步考察和优化。