刘嘉琪,杨 涛,缪芝硕,祝廷辉,邝 鼎,陈建荣,唐伟卓,*

(1.长沙学院 生物与环境工程学院,湖南长沙 410022;2.湖南海泰博农生物科技有限公司,湖南岳阳 414400)

栀子为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实,是我国传统常用中药材,为历版中华人民共和国药典所收载[1]。传统记载,栀子具有降压止血、泻火除烦、清热解毒等作用[2]。文献报道,栀子果实中含有大量油脂类成分,不饱和脂肪酸含量可达 80%[3]。栀子油脂具有多种药理活性,包括保肝、抗氧化、中枢神经改善等[4-7]。成熟栀子果实的果皮(Gardeniajasminoidespericarp)和果肉(Gardeniajasminoidespulp)容易分离,有关二者分别入药使用的记载也较早。如《本经》记载“栀子仁功善清心除烦,栀子皮则兼清表热”[8]。因此,对栀子果皮和果肉不同部位开展相关化学研究,可为栀子资源的综合开发和利用提供参考。

响应面法(Response surface methodology,RSM)是近年来广泛应用的一种实验条件优化的方法,包括了实验设计、模型建立、模型验证等步骤。该方法通过合理的实验设计以及多元二次回归方程拟合分析,同时借助直观等高线图和三维立体图分析各变量之间的交互作用,最终实现各因素水平的最优组合[9]。近年来,越来越多的文献报道了采用响应面法优化提取植物类油脂[10-15]。目前,有关栀子果实全果的油脂提取工艺和脂肪酸分析研究较多,包括了亚临界提取法[16]、超声提取法[17]、超临界提取法[18]等。但是,有关栀子不同部位油脂提取工艺的优选研究报道有限。作为一种新型的提取方法,超声辅助提取技术已经广泛应用于植物中油脂类化合物的提取[19-21]。该技术是利用超声波的机械效应、空化效应和热效应促进油脂类成分的溶出,从而达到快速、高效提取的目的。与传统的油脂提取技术相比(如浸提法、压榨法),超声辅助提取技术具有操作简易、提取率高、节能环保等优点[22-23]。

本文以石油醚为提取溶剂,考察采用超声波提取栀子果皮、果肉两个不同部位油脂的工艺。通过单因素实验和响应面法对其工艺进行优化,利用GC-MS技术对栀子不同部位油脂进行脂肪酸含量测定,旨在为栀子油脂的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“林海1号”栀子果实 由湖南海泰博农有限责任公司提供,经长沙学院陈建荣副教授鉴定为茜草科植物栀子的干燥成熟果实,药材现存放于长沙学院小分子天然药物研究室;石油醚(60～90 ℃)、甲醇 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;脂肪酸标准品(纯度>98%) 青岛科创质量检测有限公司。

ThermoFisher Trace 1310 ISQ气相色谱质谱联用仪 赛默飞世尔科技公司;TMT-3 型电子天平 湖南湘仪天平仪器设备有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海荣生化仪器有限公司;103B型高速中药粉碎机 瑞安市永利制药机械有限公司;HWS-28型电热恒温水浴锅 上海恒科学仪器有限公司;101A-2B型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂股份有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;KQ-100DE台式数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 取“林海1号”栀子干果,除去其中碎壳及质量不佳的栀子,按皮、肉分离后粉碎过60目筛,备用。

1.2.2 栀子油脂的提取 参照文献[24]报道方法,分别称取一定量的干燥样品粉末于三角瓶中,加入一定量的石油醚溶剂后置于超声波清洗器中进行超声提取。提取完成后,过滤、转入圆底烧瓶,将溶剂旋转蒸发完全,得栀子油脂提取物,烘干至恒重后,称重,计算提取率,计算公式如下:

1.2.3 单因素实验 取预处理后的实验材料进行单因素实验,考察各因素对油脂得率的影响情况,单因素水平实验表如表1所示。各单因素实验中其它固定因素水平如下。

1.2.3.1 料液比对栀子不同部位油脂得率的影响 采用1.2.2项下方法,考察料液比对栀子不同部位油脂得率的影响。提取条件为:固定超声功率400 W,提取时间30 min,考察不同料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)对栀子不同部位油脂得率的影响,进而确定最佳的料液比。

1.2.3.2 超声功率对栀子不同部位油脂得率的影响 采用1.2.2项下方法,考察超声功率对栀子不同部位油脂提取率的影响。提取条件为:固定料液比1∶10 g/mL,提取时间30 min,考察不同超声功率(240、280、320、360、400 W)对栀子不同部位油脂得率的影响,进而确定最佳的超声功率。

1.2.3.3 提取时间对栀子不同部位油脂得率的影响 采用1.2.2项下方法,考察提取时间对栀子不同部位油脂提取率的影响。提取条件为:固定料液比1∶10 g/mL,超声功率400 W,考察不同提取时间(30、45、60、75、90 min)对栀子不同部位油脂得率的影响,进而确定最佳的提取时间。

表1 单因素水平实验表

1.2.4 栀子油脂提取响应面优选试验 根据单因素实验结果,基于响应面实验设计方法中Box-Behnken Design原理,每个因素取三个水平,以油脂得率为响应值,确定超声提取栀子不同部位油脂的实验设计方案,具体响应面分析试验因素水平如表2所示。

表2 响应面法因素水平设计

1.2.5 栀子油脂提取前后样品电镜分析 为研究超声法对栀子油脂提取的作用机制,对栀子不同部位样品油脂提取前后进行扫描电镜实验。栀子果皮、果肉提取前后样品经干燥后,外表涂渍金粉,于500倍放大率下进行显微拍照。

1.2.6 栀子油脂脂肪酸GC-MS分析

1.2.6.1 样品甲酯化 称取1.0 g油脂样品于圆底烧瓶中,加入2 mL 5%氢氧化钾-甲醇溶液,放置于40 ℃水浴中反应 20 min。待反应完成后,冷却至室温,加入2 mL 正己烷溶解,并转移到10 mL容量瓶中定容。静置24 h吸取上层有机相,经0.45 μm滤膜过滤,待测。

1.2.6.2 气相色谱条件 色谱柱:TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为高纯氦气(99.999%),载气流速1.2 mL·min-1。升温程序:初始温度设为80 ℃,保持 1 min,然后以10 ℃·min-1的速率升温到200 ℃,继续以5 ℃·min-1升温到250 ℃,最后以2 ℃·min-1的速率升到270 ℃,保持3 min;进样口温度为290 ℃;样品进样量1 μL。

1.2.6.3 质谱条件 采用EI离子源;离子源温度280 ℃;溶剂延时5 min;电子能量70 eV;扫描范围为30～400 amu;分辨率为1000。

对上述检测的色谱峰采用NIST05标准谱库对分析的样品进行峰匹配,逐一对应进行定性分析,采用面积归一法进行定量分析。

1.3 数据处理

采用Excel 2016软件处理对单因素实验数据进行分析,采用Design Expert 10软件进行响应面优化实验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 栀子不同部位油脂提取单因素实验结果

2.1.1 料液比的优选 按照1.2.3.1项下方法进行实验,不同料液比对栀子不同部位油脂得率结果见图1。由图1可知,料液比对栀子不同部位油脂得率有明显影响。二者油脂得率随着料液比的增加呈现先上升后下降的变化。其中,果肉油脂得率下降的趋势更明显,但两者在料液比为1∶12 g/mL时油脂得率均达到最高。进一步增大料液比,得率开始下降。分析原因,这可能与料液比过大,溶剂量增加,样品浓度更稀,局部区域的超声波效应减小有关[24]。综合上述结果,选择料液比1∶10、1∶12、1∶14 g/mL进行后续响应面优化试验。

图1 不同料液比对栀子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影响

2.1.2 超声功率的优选 按照1.2.3.2项下方法进行实验,不同超声功率对栀子不同部位油脂得率结果见图2。由图2可知,栀子不同部位油脂得率整体上随超声功率的增加而上升,在360 W时达到最大值,随后开始下降。分析原因可能是超声功率较小时,对栀子油脂颗粒破坏越小,提取效果越差。而超声功率过大,声压幅值过高,易导致空化泡在声波压缩期内破裂不足,影响空化效果。综合上述结果,选择超声功率 320、360、400 W进行后续响应面优化试验。

图2 不同超声提取功率对栀子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影响

2.1.3 提取时间的优选 按照1.2.3.3项下方法进行实验,不同提取时间对栀子不同部位油脂得率结果见图3。由图3可知,采用超声波法提取栀子果实不同部位油脂性成分,栀子油脂的得率随提取时间的增加而升高,而后逐渐降低,在45 min 时提取率达到最高。分析原因,可能是过长的超声提取时间会导致栀子油脂颗粒破裂分散,降低得率[24]。综合上述结果,选择提取时间 30、45、60 min进行后续响应面优化试验。

图3 不同提取时间对栀子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影响

2.2 栀子不同部位油脂提取响应面试验结果

2.2.1 响应面法分析结果 在确定料液比(A)、超声功率(B)和提取时间(C)三个因素水平的基础上,基于Box-Behnken Design实验设计原理,以栀子不同部位油脂得率为响应值,进行分组实验,记录每组因素各水平组合的实验结果,实验结果见表3。

表3 响应面实验设计与结果

利用Design Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行分析,计算各项回归系数,建立数学回归模型,最终得到栀子果皮(Y1)和果肉(Y2)不同部位油脂得率的二次多项回归方程如下:

Y1=-8.39400+0.64475A+0.034606B+0.019150C-6.25000×10-4AB+3.33333×10-4AC-2.91667×10-5BC-0.017437A2-3.57812×10-5B2-1.43333×10-4C2

Y2=-173.46375+13.12812A+0.62341B+0.12200C-8.12500×10-4AB-2.25×10-3AC-1.25×10-5BC-0.52687A2-8.42187×10-4B2-7.77778×10-4C2

方程式中:A表示料液比,B为超声功率,C为提取时间。进一步对上述回归拟合方程进行方差分析,得到结果如表4所示。

表4 响应面试验方差分析

由表4可以看到,两个回归模型P值都小于0.05,说明模型影响均显著。而从其失拟项来看均不显著,说明预测值与实验值之间有较好的相关性,提示回归方程的预测值和实验值误差较小。因此,可以采用该模型进行栀子油脂超声提取实验的理论预测。进一步从各因素的P值分析,栀子果皮油脂提取实验中,A2、B2对应的P值小于0.05,说明其对栀子油脂的得率影响显著;栀子果肉油脂提取实验中,A2、B2所对应的P值小于0.01,说明其对栀子油脂得率的影响极显著。另外,液料比和超声功率交互作用对栀子果皮油脂得率的影响达到了显著水平(P<0.05)。值得注意的是,本实验中所涉及到的3个因素对栀子果皮油脂得率影响大小顺序依次为料液比(A)>提取时间(C)>超声功率(B);而这3个因素对栀子果肉油脂得率影响大小顺序依次是提取时间(C)>超声功率(B)>料液比(A)。

2.2.2 响应面数据分析及工艺优化 利用Design-Expert 8.0.6.1软件分别对上述回归方程作3D曲面图和2D等高线图,见图4、图5。各图形能够直观地反映出各因素之间的交互作用以及各因素和响应值之间的关系。一般的,由等高线的形状可以判断各因素之间的交互作用是否显著:圆形表示不显著,椭圆形或马鞍形表示显著。由图4、5可知,栀子果皮、果肉油脂提取实验中所呈现的各因素之间交互作用不同。栀子果肉油脂提取实验中,料液比(A)和超声功率(B)等高线图呈明显的椭圆形,表明两因素间交互作用较显著,而栀子果皮油脂提取实验中,这两个因素间交互作用不明显;另外,在栀子果肉油脂提取实验中,料液比(A)和提取时间(C)、超声功率(B)和提取时间(C)的等高线图呈圆形,表明上述两对因素间交互作用不明显。

图4 各因素对栀子果皮油脂提取率交互作用的等高线和响应面图

图5 各因素对栀子果肉油脂提取率交互作用的响应面和等高线图

从响应曲面图分析来看,栀子不同部位油脂提取实验中,油脂的得率受液料比的影响较大,超声功率对得率的影响较小。由AC两因素响应曲面图可以看出,栀子油脂得率随提取时间和料液比的变化呈先升高后降低的趋势。由BC两因素响应面曲面图可得,当超声功率一定,栀子油脂得率随着提取时间的增大而增大,随后有所下降。而当提取时间一定时,随着超声功率的增大,油脂得率增加到一定的程度后逐渐降低。为了获得超声提取栀子油脂的最佳工艺参数,令回归方程Y1和Y2等于0并对方程中的自变量分别求偏导,得到栀子果皮油脂的最佳工艺条件为:料液比1∶13.41 (g/mL)、超声功率320 W、超声时间60 min;栀子果肉油脂的最佳提取工艺为:料液比1∶12.05 (g/mL)、超声功率363.83 W、超声时间58.02 min。

2.2.3 最佳工艺验证实验 为检验上述回流提取工艺条件的可靠性,在最佳工艺条件下进行3次验证实验,结果取平均值。考虑实际操作的方便和可行性,将最佳提取工艺参数调整为:栀子果皮:料液比1∶13 g/mL、超声功率320 W、提取时间60 min。栀子果肉:料液比1∶12 (g/mL)、超声功率360 W、提取时间58 min。在此要求及工艺条件下,栀子果皮和果肉油脂的得率可达到2.36%和22.60%。该结果与理论预测值接近,说明运用响应面分析法提供的模型准确可靠。

2.3 栀子不同部位油脂超声提取电镜结果分析

为了更好地了解超声提取对栀子不同部位油脂的提取机制,分别对栀子果皮、果肉超声提取前后的样本进行了SEM实验。从图6可以看出,提取前后,栀子果皮和果肉细胞出现了明显的变化。超声提取前,栀子果皮和果肉细胞外面呈光滑状,排列比较平整。提取后,果皮细胞和果肉细胞均呈现了不同程度的破裂,尤其是果肉细胞更为明显。上述现象表明,超声促使了栀子果皮和果肉细胞的快速破裂,促进油脂性成分的溢出,有利于石油醚提取。

图6 栀子不同部位油脂超声提取前后电镜结果分析图

2.4 栀子果皮和果肉油脂性成分的GC-MS分析结果

结合上述栀子不同部位油脂的提取实验结果,对制备的栀子不同部位油脂样本进行GC-MS实验,采用峰面积归一化法对其含量进行分析。

栀子不同部位油脂样品测定的总离子流色谱图如图7,各部位油脂的脂肪酸组成及相对含量分析见表5。

表5 栀子不同部位油脂脂肪酸组成及相对含量分析

图7 栀子果皮(A)和栀子果肉(B)油脂GC-MS总离子流色谱图

由表5可知,栀子果肉油脂中共检测到13种不同脂肪酸成分,主要含有亚油酸、油酸和棕榈酸3种脂肪酸。其中,不饱和脂肪酸的相对含量达到75.97%,以油酸为主(21.90%)和亚油酸为主(52.70%)。另外,栀子果肉油脂中饱和脂肪酸相对含量为24.03%,主要以棕榈酸为主(17.90%);从栀子果皮油脂中共检测到19种脂肪酸成分,其主要脂肪酸类型和栀子果肉油脂类似,主要含有油酸、亚油酸和棕榈酸。其中不饱和脂肪酸相对含量为69.22%,比果肉部位偏低,以亚油酸(44.80%)和油酸(13.55%)为主。但是,栀子果皮油脂中饱和脂肪酸相对含量为30.82%,要高于栀子果肉部位,主要以棕榈酸为主(21.80%)。另外,值得注意的是,栀子果皮部位油脂中检测出一定量的α-亚麻酸(9.58%),而栀子果肉部位油脂中α-亚麻酸的含量仅有0.95%。上述结果从脂肪酸组成角度揭示了栀子果皮和栀子果肉不同部位油脂性成分存在一定的差异性。

3 结论

本文以石油醚为提取溶剂,利用Box-Behnken响应面法优选超声提取栀子不同部位油脂的最佳工艺条件。结果得出,栀子果皮油脂的最佳提取工艺为:料液比1∶13 (g/mL)、超声功率320 W、提取时间60 min;栀子果肉油脂的最佳提取工艺为:料液比1∶12 (g/mL)、超声功率360 W、提取时间58 min。在上述条件下,栀子果皮和果肉油脂的得率可达到2.36%和22.60%。另外,对栀子果皮和果肉油脂GC-MS分析结果显示,二者的脂肪酸数量和含量存在一定的差异。栀子果肉油脂中共检测到13种脂肪酸成分,而栀子果皮油脂中共检测到19种脂肪酸成分。从主要成分含量上分析,栀子果肉油脂中不饱和脂肪酸的相对含量达到75.97%,以油酸为主(21.90%)和亚油酸为主(52.70%)。栀子果皮油脂中不饱和脂肪酸的相对含量较栀子果肉部位偏低(69.22%),以油酸为主(13.55%)和亚油酸为主(44.80%)。但是,栀子果皮油脂中饱和脂肪酸的含量要高于栀子果肉部位。另外,还发现栀子果皮油脂中存在一定量的α-亚麻酸成分,而栀子果肉油脂中含量偏低。上述结果为栀子不同部位油脂的综合利用和开发提供一定的参考。值得思考的是,栀子不同部位油脂性成分的差异与栀子传统分部位入药的联系究竟如何？栀子不同部位中非油脂性成分是否也存在较大差异？上述两大类成分的区别与栀子不同部位的药理活性的关联如何？这些问题有待后续进一步研究。