张开屏,马牧然,曹凯慧,马俊杰,田建军,*

(1.内蒙古商贸职业学院食品工程系,内蒙古呼和浩特 010070;2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

目前全球食品安全主要是由微生物危害及化学危害引起的食源性疾病,这在世界范围内造成了严重的经济及社会影响[1-2],因此减轻食源性疾病对人类健康及社会影响已成为一个十分重要的问题。食源性致病菌主要包括细菌、霉菌、病毒等,通过摄食进入人体后会引起相关食源性疾病。常见的食源性致病菌有:大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等[3]。其中金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在,是一种兼性厌氧的革兰氏阳性(G+)菌[4],可分泌20 多种毒性蛋白质,其中由肠毒素A造成的食物中毒需要量仅为100 ng[5]。2015年,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全球已居第4位[6]。从2005年起,金黄色葡萄球菌在美国已导致94000多起严重感染事件及18000多起致死事件[7]。大肠杆菌也称大肠埃希氏菌,属革兰氏阴性(G-)菌,通常对人体无害,是衡量食品是否受粪源性污染的重要指标。而大肠杆菌属中存在一些血清型特殊的菌种,它们对人体是有害的,人体摄入被该类细菌污染的食品即可发生感染,严重的甚至会造成死亡[8-9]。

到目前为止,已报道的250多种食源性疾病中与细菌相关的暴发性食物中毒事件约占三分之二[10],由此可见降低由食源性致病菌引起的健康疾病问题是提高食品安全性的重要方面。近些年的研究表明,除了如亚硝酸盐、山梨酸、苯甲酸这些众所周知的由于使用不当会对人体造成伤害的防腐剂外,一些原本被认为安全的合成防腐剂也可能具有致癌风险[11]。因此探寻具有可抑制致病菌且不会对人体健康造成伤害的新抑菌剂就变得非常有意义。益生菌是指当摄入一定量时对宿主能产生有益效果且能够繁殖的微生物菌体[12]。多数乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是在世界范围内被公认为“generally recognized as safe(GRAS)”等级的食品微生物[13]。具有益生作用的乳酸菌进入人体,可通过与肠道菌群相互作用,影响肠道微生物的代谢活动和生理功能,如肥胖、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化疾病等的发生可能与肠道菌群失衡存在某些关系[14-15]。此外乳酸菌还因其具有抗氧化[16]、降胆固醇[17]、增强免疫力[18-19]等作用而被广为人知。而乳酸菌的另一个关键属性就是其本身可分泌产生多种抑菌物质,从而展示出不同程度的抗菌活性[20]。因此本研究从肉制品中分离得到的肉源乳酸菌中筛选具有抑菌活性的乳酸菌菌株,并研究其抑菌特性,对降低由食源性致病菌导致的肉制品安全问题具有重大指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

指示菌:大肠杆菌ATCC25922(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌B-250(Staphylococcusaureus)标准菌株 内蒙古农业大学食品科学与工程学院微生物实验室提供,19株肉源乳酸菌由内蒙古农业大学肉品科学团队从牧区风干肉制品中分离获得,鉴定结果见表1;脱脂乳培养基(蒸馏水100 mL、脱脂乳粉10 g、酵母提取粉0.1 g,110 ℃,10 min灭菌)、水琼脂培养基(琼脂粉15 g/L,121 ℃,15 min灭菌)、营养琼脂培养基(相应乳酸菌培养基或指示菌培养基与琼脂粉混合,琼脂粉15 g/L,121 ℃,15 min灭菌) 实验室自配;TPY培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶(分析纯、酶活力>30 U/mg) 北京Coolaber科技有限公司;乳酸标准品、乙酸标准品、丙酸标准品 色谱纯,德国Dr Ehrenstorfer公司;胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、琼脂、L-半胱氨酸 广东环凯微生物技术有限公司;氯化钠、氯化镁、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁 国药集团化学试剂有限公司。

表1 试验菌株

KG-SX-500全自动高压灭菌锅 KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC;T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Eppendorf低温离心机 艾本德中国有限公司;JM-A3002电子天平 诸市超泽衡器设备有限公司;ZHJH-C1112B超净台、ZHJH-A2234A生物安全柜 南京博尔迪生物技术有限公司;HH-4恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司;LRH恒温培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌上清液的制备 将保存状态的乳酸菌接种到脱脂乳培养基中进行一代活化(37 ℃,24 h),然后将一代菌接种到TPY液体培养基中进行二、三代活化(接种量2%,37 ℃,24 h),最终将三代活化菌的发酵液离心(4000 r/min,5 min)取上清,即得乳酸菌发酵上清液[21]。

1.2.2 指示菌菌悬液的制备 将未活化的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌分别接种于LB液体培养基中,活化三代(接种量2%,37 ℃,24 h),将活化好的菌液调至浓度为107CFU/mL的菌悬液备用[21]。

1.2.3 菌落计数 将活化好的乳酸菌及指示菌用0.85%的生理盐水分别进行10倍梯度稀释,选取合适梯度的稀释菌液1 mL与营养琼脂培养基混合,37 ℃培养48 h后进行计数[21]。

1.2.4 乳酸菌上清液抑菌效果测定 采用牛津杯双层琼脂扩散法检测19株乳酸菌上清液的抑菌特性。将灭菌的水琼脂倾注于培养皿底层,待其干后在其上放置牛津杯,每个培养皿放置6个。取含107CFU/mL的指示菌100 μL与营养琼脂培养基混合倾注于放置好牛津杯的培养皿内,待其干后拔下牛津杯,向孔内分别打入19株乳酸菌上清液(上清液均取自含有108CFU/mL的乳酸菌发酵液),每孔200 μL,将培养皿放入恒温培养箱,经37 ℃培养24 h后取出观察结果,用游标卡尺测量抑菌圈直径[21]。

1.2.5 乳酸菌耐盐、耐亚硝酸盐及耐酸特性研究 将活化好的19株二代乳酸菌分别接种至含6% NaCl的TPY液体培养基、调酸碱度(1.0 mol/L的HCl调)使pH=5的TPY液体培养基及含亚硝酸盐(亚硝酸钠100 mg/kg)的TPY液体培养基内,同时以未进行上述处理的乳酸菌为对照,37 ℃培养24 h后在波长为600 nm条件下测其吸光值[22]。

1.2.6 乳酸菌上清液抑菌的物质基础研究

1.2.6.1 酸敏感性测定 取经筛选的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH调其pH至5.0,以未进行pH调节的上清液为对照,根据方法1.2.4对其抑菌效果进行检测[21]。

1.2.6.2 蛋白酶敏感性测定 参考文献[22],取经筛选的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH分别调其pH为蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶的最适pH(最适pH分别为7.4、2.0、7.4),并按最终浓度为1.0 mg/mL的量分别加入上述各酶,放入37 ℃的水浴锅中保温2 h,再用1.0 mol/L的HCl、NaOH调回其初始pH,以未进行蛋白酶处理的上清液为对照,根据方法1.2.4对其抑菌效果进行检测。

1.2.6.3 过氧化氢酶敏感性测定 取经筛选的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH将其pH调至过氧化氢酶的最适pH(pH为7)并按最终浓度为1.0 mg/mL的量加入,置于37 ℃的水浴锅中保温2 h,再用1.0 mol/L的HCl、NaOH调回其初始pH,以未进行过氧化氢酶处理的上清液为对照,根据方法1.2.4对其抑菌效果进行检测[22]。

1.2.7 乳酸菌上清液抑菌效果的影响因素研究

1.2.7.1 pH对乳酸菌上清液抑菌效果的影响 将经筛选乳酸菌的上清液分pH对抑菌效果的影响,分别用1.0 mol/L的HCl、NaOH调节经筛选的乳酸菌上清液pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,以未调pH的上清液为对照,按方法1.2.4检测其抑菌效果[22]。

1.2.7.2 温度对乳酸菌上清液抑菌效果的影响 热处理对抑菌效果的影响,分别在60、80、100 ℃的温度下加热30 min,在121 ℃下灭菌处理15 min,以未进行加热处理的上清液为对照,按方法1.2.4检测其抑菌效果[22]。

1.3 数据处理

使用数据处理软件IBM SPSS Statistics 25进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌上清液抑菌效果测定结果

用牛津杯双层琼脂扩散法检测19株乳酸菌上清液对指示菌的抑制效果,结果如表2所示。

表2 乳酸菌发酵上清液抑菌效果

由表2可知,19株乳酸菌对大肠杆菌的平均抑菌圈直径为(12.25±1.78) mm,19株乳酸菌对金黄色葡萄菌的平均抑菌圈直径为(12.21±1.18) mm,不同乳酸菌对同种指示菌的抑菌效果不尽相同;而同种乳酸菌对不同指示菌的抑菌效果也不同,以上结果说明乳酸菌上清液的抑菌效果具有特异性。根据19株乳酸菌上清液抑菌圈直径间的显著差异性,分别选取对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果高、中、低的F19、F3、F18和F16、F13、F11为后续试验所用菌种。

2.2 乳酸菌耐盐、耐亚硝酸盐及耐酸特性分析

对已筛选出的F19、F3、F18、F16、F13、F11乳酸菌的耐盐、耐亚硝酸盐及耐酸特性进行分析,分析结果如表3所示。

表3 所筛选6株乳酸菌耐盐、耐亚硝酸盐及耐酸特性分析

由表3可知,实验菌株表现为对100 mg/kg的亚硝酸盐耐受性较好,对pH=5.0的酸性环境耐受性次之,对6% NaCl耐受性较差。

抑制大肠杆菌的F19、F3、F18乳酸菌在含亚硝酸盐(100 mg/kg)环境中培养24 h 后OD600值均显著高于平均水平(P<0.05);在含6% NaCl环境中培养24 h后F3、F18 的OD600值均显著高于平均水平(P<0.05),F19略低于平均水平;在pH=5条件下培养24 h后F19、F3、F18的OD600值均显著高于平均水平(P<0.05)。抑制金黄色葡萄球菌的F16、F13、F11乳酸菌在含亚硝酸盐(100 mg/kg)环境中培养24 h 后OD600值均显著高于平均水平(P<0.05);在含6% NaCl环境中培养24 h后F13、F11的OD600值均显著高于平均水平(P<0.05);在pH=5条件下培养24 h后F16的OD600值显著高于平均水平(P<0.05),F11与平均水平无显著差异(P>0.05),F13略低于平均水平。由以上分析可知,本试验所选6株乳酸菌在耐亚硝酸盐(100 mg/kg)、耐盐(6% NaCl)、耐酸(pH=5)特性方面表现良好,可供在发酵香肠生产中使用。

2.3 乳酸菌上清液抑菌物质的分析

2.3.1 上清液对大肠杆菌抑菌物质的分析 如图1所示,F19、F3、F18上清液中加入过氧化氢酶后抑菌圈直径也有显著下降(P<0.05);经蛋白酶处理后抑菌圈直径也有显著下降(P<0.05),说明F19、F3、F18乳酸菌上清液中存在过氧化氢和细菌素并起到抑菌作用。F19、F3、F18上清液与对照组相比,经调节pH至5.0的上清液进行抑菌试验时未出现明显抑菌圈,经调节pH后的抑菌圈与对照组(15.07±0.55 mm)差异性最大,说明酸性环境是实验乳酸菌上清液中抑菌的主要原因。

图1 抑制大肠杆菌乳酸菌发酵上清液抑菌物质分析

2.3.2 上清液对金黄色葡萄球菌抑菌物质的分析 如图2所示,F16、F13清液经过氧化氢酶处理后的抑菌圈直径也有显著下降(P<0.05);加入蛋白酶后抑菌圈直径也有显著下降,说明F16、F13、F11乳酸菌上清液中存在过氧化氢和细菌素并起到抑菌作用。F11上清液经蛋白酶K和胃蛋白酶处理后抑菌圈直径较对照组显著下降(P<0.05),经胰蛋白酶、过氧化氢处理后抑菌圈直径与对照组无显著差异(P>0.05)。F16、F13、F11上清液排除酸的影响后未出现明显抑菌圈,统计分析表明经调节pH至5.0后的抑菌圈与对照组差别最大(P<0.05),说明酸性环境是上述3株乳酸菌上清液中发挥抑菌活性的主要原因。

图2 抑制金黄色葡萄球菌乳酸菌上清液抑菌物质分析

2.4 乳酸菌上清液抑菌效果的影响因素分析

2.4.1 pH对抑菌效果的影响 pH对抑制大肠杆菌和抑制金黄色葡萄球菌的影响分别见表4和表5。

表4 pH对抑制大肠杆菌的影响

表5 pH对抑制金黄色葡萄球菌的影响

不同乳酸菌上清液在相同pH条件下抑菌能力不同,表4中pH为2.0时抑菌能力表现为F18>F19>F3,且相互存在显著差异(P<0.05),pH为3.0时F19与F3间无显著差异(P>0.05),与F18差异显著(P<0.05),pH为4.0时仅F19上清液有抑菌活性,而未进行pH处理的对照组抑菌能力表现为F19>F3>F18,且相互间显著差异(P<0.05)。由以上结果可知,在特定pH条件下不同乳酸菌具有的抑菌能力是不同的,且随着pH的升高,抑菌能力会下降,这也从一个方面反映出pH对乳酸菌上清液的抑菌效果存在很大影响。

由测定结果可知，与对照组即未进行pH调节的上清液相比,pH为2.0时抑菌效果最强,且显著优于对照组(P<0.05),pH为4.0时F3、F18、F11上清液已无抑菌活性,F19、F16、F13上清液虽具有抑菌活性,但其抑菌能时力也显著低于对照组(P<0.05)。继续升高pH分别至5.0、6.0、7.0时全部乳酸菌上清液均不显示抑菌能力。在特定pH条件下不同乳酸菌具有的抑菌能力是不同的,且随着pH的升高,抑菌能力会下降。

产生这种结果的原因可能是由于在低pH条件下,有机酸处于未解离状态,对有害菌的抑制能力较强。此外有研究报道,乳酸菌代谢产物中一些非蛋白类物质在低pH环境中活性增强,会共同抑制病原菌。另外不同致病菌对酸的耐受程度不同,往往在越低的pH环境中它们越难生存。故乳酸菌上清液在越低的pH条件下显示出越高的抑菌能力。

2.4.2 热处理对抑菌效果的影响 乳酸菌上清液在不同温度下处理一定时间,分析热处理对菌液抑菌能力的影响,结果如图3所示。

图3 热处理对抑制指示菌的影响

F18上清液在热处理后其抑菌圈直径与对照组相比无显著差异(P>0.05);F11上清液分别在60、80 ℃处理30 min后与对照组相比抑菌圈直径均未出现显著下降(P>0.05),说明F18、F11上清液的抑菌物质热稳定性较好。F19、F3、F16、F13乳酸菌上清液在不同温度下热处理后,其抑菌圈直径较对照组均有显著下降(P<0.05),且减小趋势基本为处理温度越高,抑菌圈直径越小。其中F16上清液经60 ℃处理30 min后的抑菌圈直径为(13.33±0.46) mm,经80 ℃处理30 min后为(11.83±0.74) mm,经100 ℃处理30 min后为(11.23±0.32) mm,经121 ℃处理15 min后为(10.20±0.44) mm,除80、100 ℃无显著性差异外，以上抑菌圈直径间均有不同程度的显著性差异(P<0.05),且与对照组(14.47±0.38 mm)相比均有显著下降(P<0.05),说明不同温度热处理一段时间会对抑菌效果产生一定影响,且处理温度越高,影响越明显。

产生上述结果的原因是其中的抑菌物质可能因为热处理而发生性质改变,但用本试验方法处理的乳酸菌上清液因有机酸发生化学变化或物理损失而造成抑菌圈直径下降的可能性很小,因为大部分乳杆菌都产生L-乳酸[23](本试验所用乳酸菌经鉴定大部分为乳杆菌),而L-乳酸较稳定,在本方法处理条件下,其发生变化或损失的可能性很小。

结合2.3对抑菌物质的分析,发现上清液中普遍存在过氧化氢与细菌素,可能为上清液中的过氧化氢因受热而发生分解导致抑菌效果下降,或细菌素发生改变,因为细菌素是一种不耐热的蛋白质细菌素,故可能是上清液中该类细菌素受热后失活而致抑菌效果下降。

3 讨论和结论

肉源乳酸菌抑菌的主要原因为上清液中的酸性环境,或抑菌物质在酸性条件下才能发挥抑菌活性,也考虑为酸的存在大大降低环境pH导致致病菌无法生存。经蛋白酶处理的肉源乳酸菌F13、F16上清液的抑菌效果均有显著下降(P<0.05),而细菌素(Bacteriocin)是指细菌在正常生理代谢过程通过核糖体合成的一类能够发挥抗菌活性的多肽或蛋白质复合物,它们对蛋白酶敏感,说明所选乳酸菌上清液中存在细菌素,并在抑菌中发挥了抑菌活性。经过氧化氢酶处理的肉源乳酸菌F13、F16上清液的抑菌效果均有显著下降(P<0.05),说明所选肉源乳酸菌F13、F16上清液中存在过氧化氢,并在抑菌中发挥了抑菌活性。

19株从牧区风干肉制品中分离得到的肉源乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径分别为(12.25±1.78) mm和(12.21±1.18) mm,其中菌株F19对大肠杆菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(15.07±0.55) mm,而F11上清液对大肠杆菌完全没有抑制效果,菌株F16对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(14.47±0.38) mm,而F6、F2上清液对金黄色葡萄球菌完全没有抑制效果。

对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力有显著差异(P<0.05)的乳酸菌F19、F3、F18及F16、F13、F11上清液的抑菌物质基础是酸性环境在其抑菌过程中占主导地位,细菌素与过氧化氢发挥协同作用。不同温度热对上清液处理一定时间与调节上清液pH都会影响上清液的抑菌效果,且随热处理温度提高,抑菌效果呈下降趋势;pH越低,越利于发挥抑菌效果。

综上所述,本试验所用乳酸菌上清液中发挥抑菌主导作用的是有机酸,细菌素与过氧化氢发挥协同作用,这与Taheri等[24]在对142株乳酸菌上清液进行抑菌试验后得出的结果类似,与熊骏等[25]从豆豉中分离出的YM-4-3乳杆菌抑菌结果也具有相似性。说明从牧区风干肉制品中分离得到的肉源乳酸菌在抑菌效果和抑菌机理方面与从其它产品中分离得到的乳酸菌研究结果相辅相成。