马钦海，陈瑞晗，杨子峰，2，3

(1.广州医科大学附属第一医院，广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室/国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，广东 广州 511436；2.澳门科技大学中医药学院，澳门 519020；3.金域医学病毒诊断与转化中心，广东 广州 510725)

截至2020年10月19日，全球共确诊新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病人约4 014万例，其中1 116 761例死亡，疫情范围包括日本、韩国、意大利、新加坡、伊朗、泰国和美国等200多个国家和地区，已升级为国际关注的突发公共卫生事件，严重危害人民生命健康和社会经济秩序[1-2]。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要经呼吸道飞沫和密切接触传播，临床症状包括发烧和咳嗽以及呼吸困难、头痛、肌肉酸痛、疲劳等其他非特定症状。随着疾病的发展，部分病人会快速进展为多器官功能衰竭的状态，病情凶险，死亡率较高[3-4]。然而，疫情暴发以来，临床治疗手段多以退热、呼吸支持等对症治疗为主，临床特效药物缺乏。COVID-19的临床表现及病情发展特征，属于中医“瘟疫”“温病”或“疫毒”范畴，有着“湿、热、毒、疫”的病理特点，其病机主要是“毒损肺络”并累及脾胃等脏腑，与现代医学中“感染性肺损伤”的病理基本一致，治疗策略多以清热解毒、扶正祛邪为主。多个版本《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》突出中医治疗方案，并提倡因地制宜、因人而异开展辨证论治，目前已取得了良好效果[5-6]。

六神胶囊源于《雷允上诵芬堂方》，由人工牛黄、麝香、珍珠、冰片、蟾酥、雄黄6味中药组成，其中人工牛黄、麝香为君，清热解毒，活血散结；臣以蟾酥、珍珠、雄黄加强解毒之力；佐以冰片加强散结消炎作用。六药配伍具有清热解毒、化痰散结、消肿止痛之功效，常用于扁桃体炎、咽炎、流感等疾病的治疗[7-8]。近年来，有研究发现六神胶囊具有广泛的药理特性，如抗炎、抗癌、抗病毒、镇痛、抗菌和免疫调节活性[9-12]，前期研究也发现：六神胶囊在病毒复制的不同阶段对流感病毒均有明显的抑制作用；六神胶囊可降低病毒滴度和肺指数，有效延长小鼠的存活时间；六神胶囊能显著降低感染细胞和小鼠体内炎症因子的水平[13]。在此次COVID-19诊疗建议方案中，六神胶囊也被多个地区推荐用于风热犯肺证患者的治疗[14]。

网络药理学基于疾病-基因-靶向药物相互作用，系统、全面地分析药物对疾病网络的影响，其多组分、多靶点的特点与中医的治疗理念相吻合[15-16]。分子对接是研究分子间(小分子配体和受体生物大分子)相互作用，预测其结合模式和亲和力来进行药物设计的方法[17]。本研究拟通过网络药理学筛选出有活性的单体化学成分，建立中药-有效活性成分-靶点网络，得出六神胶囊中核心活性单体，对核心活性单体与靶点进行分子对接，为系统地探讨六神胶囊治疗COVID-19的作用机制提供参考，也为后期深入研究和治疗COVID-19提供新思路。

1 方法

1.1 六神胶囊有效化学成分的筛选

利用常用的网络药理学数据库和文献检索数据库TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、中国知网(http://www.cnki.net/)以及Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)检索六神胶囊的主要化学成分。由于应用以上数据库检索未发现珍珠中相关活性成分，本研究从人工牛黄、麝香、冰片、蟾酥和雄黄这5味药进行深入研究。

采用网络药理学常用筛选方法，以TCMSP数据库药物单体的类药性(Drug-likeness，DL)大于0.18且口服利用度(Oral bioavailability，OB)大于30%为筛选标准，纳入候选的有效活性成分。对于在TCMSP数据库中未收录的药物，以BATMAN-TCM、TCMID数据库中检索到的药物活性成分以及文献中经气相/液相色谱质谱鉴定的单体为基础，进一步使用TCMSP数据库查找单体OB及DL筛选候选单体。另外结合参考文献，对于未能入选，但是文献报道有生物活性和药理作用的单体也纳入候选活性成分，建立药物-活性单体分子数据集。

1.2 中药-有效活性成分-靶点网络的构建

利用TCMSP、BATMAN-TCM数据库检索候选活性成分靶点。将收集的靶点导入UniProt数据库进行靶点基因名称校正，剔除没有靶点的活性成分，建立有效活性成分-作用靶点数据库，再将方中药材、化合物、靶点导入Cytoscape 3.6.1软件构建药材-化合物-靶点网络。设置节点度值(Degree)大于所有节点连接度中位数2倍为标准进行筛选，确定关键节点，探讨六神胶囊的潜在物质基础[18]。度中心性(DC)、中间中心性(BC)和接近中心性(CC)是网络药理学研究中评价网络节点重要性的核心参数，值越大，越可能起到重要作用[19]。

1.3 靶点通路分析

Metascape平台(http://metas cape.org)是一个基因功能注释分析数据库，用生物信息学方法来分析基因的生物学过程和途径。将六神胶囊治疗SARS-CoV-2的潜在靶点输入到Metascape平台。提交后，属性设置为Home sapiens，P<0.01。对目标进行GO富集分析、KEGG和Reactome信号通路分析，并保留分析结果。根据每个条目中涉及的靶点数量进行排序，从而筛选排名靠前的富集通路和生物过程。

1.4 成分-靶点分子对接

先从RSCB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6Y2E)、血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)(PDB ID：1R42)以及SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)(PDB ID：6m71)的3D结构pdb格式文件，运用Molecular Operating Environment 2019 Client软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)，再保存为pdb文件。从PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物2D结构的sdf格式文件。利用Autodock tools软件先上传去水加氢后的蛋白质文件，将其转化为pdbqt格式文件，再上传化合物文件使其能量最小化，并将其转化为pdbqt格式文件，最后运用autodock vina进行对接。结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，研究选取结合能≤-5.0 kJ/mol的活性成分作为六神胶囊治疗COVID-19靶点的筛选依据。

2 结果

2.1 有效活性成分筛选

通过TCMSP、BATMAN-TCM等数据库以及文献数据库检索，收集到六神胶囊有效活性化学成分192个。对检索到的各中药化学成分采用OB和DL两个指标以及文献报道有生物活性和药理作用进行筛选，总共纳入132个有效活性成分。

通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库检索候选活性成分的靶点，共检索到132个有效活性成分对应的2 082个作用靶点，在活性成分与靶点的对应中，普遍存在一个活性成分有多个靶点以及多个活性成分对应一个靶点的特征。

2.2 中药-有效成分-靶点网络

将筛选出的132个六神胶囊的有效活性成分和其对应的2 082个靶点以及对应的中药，导入Cytoscape软件形成六神胶囊的中药-有效活性成分-有效靶点网络图(图1)。图中不同颜色的节点分别代表六神胶囊药物(红色)、潜在的有效活性成分(蓝色)、有效活性成分靶点(绿色)，节点的大小代表节点度的大小。网络共有2 214个节点，8 422条边，平均每个节点有3.8条边。其中Degree排名前10的靶点分别是PTGS2、ESR1、PLA2G1B、PTGS1、CES1、ADORA1、COX1、COX2、COX8A及NR3C1(表1)，它们受到26个以上活性成分调节。其中Degree排名前20的单体大部分是人工牛黄、蟾酥、冰片和麝香的有效成分，分别为γ-氨基丁酸、17β-雌二醇、5-顺式环十五烯酮、5-顺式环十四烯酮、雄甾-4-烯-3,17-二酮、睾酮、德洒明碱、蟾酥硫碱、鹅去氧胆酸、5-甲氧基-N,N-二甲基色胺、麦角胺、麦角胺宁、熊果酸、尿囊素、β-榄香烯、α-蒎烯、3-蒈烯、血红素、β-丁香烯、胆甾醇[20-26]。

表1 度值排名前10的靶点

2.3 靶点通路分析

Metascape中GO功能富集分析得到GO条目495个(P<0.05)，分为3个模块，分别是生物学过程(Biological process，BP)条目287个、细胞组成(Cellular component，CC)条目96个、分子功能(Molecular function，MF)条目112个，结果见图2。

KEGG通路富集筛选得到107条信号通路(P<0.05)，主要涉及免疫和炎症(Hepatitis B, HTLV-Ⅰ infection，Influenza A，Tuberculosis)，细胞生长、代谢、凋亡相关通路(cAMP，cGMP-PKG，Calcium，MAPK，Thyroid hormone，Estrogen)，癌症通路(Pathways in cancer)，神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction，Morphine addiction，Amphetamine addiction)等。结果见图3。

Reactome通路富集筛选得到85条信号通路(P<0.05)，主要涉及G蛋白偶联(Gαisignalling events)、白细胞介素信号(Signaling by interleukins，interleukin-4 and interleukin-13 signaling)、受体酪氨酸激酶信号(Signaling by receptor tyrosine kinases)、基因转录(Transcriptional regulation by TP53)、神经系统(Neuronal system)等通路，结果见图4。

2.4 六神胶囊有效活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2、SARS-CoV-2 RdRp分子对接结果

一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。将六神胶囊在中药-有效活性成分-有效靶点网络中度值≥2倍成分度值中位数的20个核心活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行分子对接，以结合能-5.0 kJ/mol作为筛选标准[27]。分子对接结果表明，与3CL水解酶结合能小于-5.0 kJ/mol的核心活性化合物有17个，其中结合能最低的化合物是人工牛黄中的有效成分麦角胺(结合能为-13.6 kJ/mol)、熊果酸(结合能为-13.1 kJ/mol)、鹅去氧胆酸(结合能为-10.0 kJ/mol)。ACE2被报道是SARS-CoV-2进入细胞所需的受体，SARS-CoV-2 RdRp在SARS-CoV-2的复制和转录周期中起着重要的作用。六神胶囊20个核心活性化合物及目前已报道可能具有抗SARS-CoV-2作用的化学药分别与ACE2和SARS-CoV-2 RdRp进行分子对接，结果见表2，图5为与3种蛋白进行对接结合能最低的3种活性成分。

表2 六神胶囊中核心化合物与SARS-CoV-2 3CL、ACE2以及SARS-CoV-2 RdRp的结合能量

3 讨论

根据COVID-19的症状表现，中医认为COVID-19属于中医学“疫病”范畴，病因为感受疫疠之气，主要为湿邪疫毒。疫毒首先犯肺，病位在肺，时及脾胃，病机特点为“湿、热、毒、瘀”。治则治法多以清热解毒为主，兼顾扶正。“清热”作为“祛邪”的重要手段之一，是多数病毒感染性疾病的主要治疗方法。各地区诊疗方案基本按照预防、治疗、恢复三个阶段采取不同措施，预防阶段以玉屏风散等益气固表为主，治疗期以清热化湿，解毒救逆为主，恢复期以益气养阴为主[28-29]。六神胶囊为吴门医派温病学清热解毒名方，国医大师朱良春赞誉六神胶囊“确是仓促救急妙方，扶危拯脱之良药”，治疗热病及炎症疾病疗效显著[30]。前期实验研究表明，六神胶囊在病毒复制的不同阶段(病毒感染前、病毒感染后和病毒共感染)对流感病毒有明显的抑制作用。六神胶囊(100 mg/kg和50 mg/kg)能有效延长小鼠的存活时间，且能显著改善感染细胞和小鼠的IL-1β等炎症因子表达及NF-κB信号通路的紊乱[13]。本研究基于网络药理学和分子对接技术，系统地阐述六神胶囊治疗COVID-19的物质基础和分子机制。

通过对六神胶囊中活性成分进行数据库筛选共检索到132个活性成分对应的2 082个作用靶点。通过构建中药-有效成分-有效靶点网络，连接中药、有效成分或有效靶点较多的节点在整个网络中起到中央枢纽的作用，可能是关键的化合物或靶点，其中人工牛黄、蟾酥、冰片和麝香的有效成分最多。网络图中可以看出一种中药成分中含有多种活性成分，在活性成分与靶点的对应中，普遍存在一个活性成分有多个靶点以及多个活性成分对应同一靶点的特征。

网络药理学分析排名前4位的靶点分别是PTGS2、ESR1、PLA2G1B和PTGS1，均是熊果酸的作用靶点。KEGG和Reactome分析得到与PTGS2、ESR1、PLA2G1B和PTGS1有关且排名靠前的通路是抗病毒、免疫、抗炎、细胞代谢相关的通路。SARS-CoV-2会刺激机体分泌大量的炎症因子，从而引发炎症风暴，造成机体过度免疫应答反应，致使组织细胞出现弥漫性损伤，出现肺部纤维化及多器官功能障碍甚至死亡。而靶点通路分析结果显示，六神胶囊中的有效成分可调节SARS-CoV-2感染所致的PTGS2等炎症代谢通路紊乱。而前期研究也同样发现，六神胶囊具有抑制SARS-CoV-2体外复制作用，并能显著改善SARS-CoV-2感染诱导的炎症紊乱[31]。

将核心化合物及目前临床推荐使用的化学药与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行分子对接对比，研究发现六神胶囊中核心活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能与化学药相近甚至优于化学药，其中麦角胺(-13.6 kJ/mol)、熊果酸(-13.1 kJ/mol)和鹅去氧胆酸(-10.0 kJ/mol)均低于瑞德西韦(-9.6 kJ/mol)、氯喹(-5.7 kJ/mol)、法匹拉韦(-5.5 kJ/mol)、瑞托那韦(-8.7 kJ/mol)和利巴韦林(-6.9 kJ/mol)的结合能，一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大，由此可见六神胶囊中的核心化合物与受体蛋白SARS-CoV-2 3CL水解酶构象能量低，结构稳定，结合活性较高。与其他冠状病毒(如SARS-CoV)一样，SARS-CoV-2表面Spike糖蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体ACE2蛋白结合，使病毒入侵人体，从而广泛传播[32]。本研究将麦角胺、熊果酸、鹅去氧胆酸、瑞德西韦、氯喹、法匹拉韦、瑞托那韦和利巴韦林与ACE2进行分子对接，结果显示麦角胺、熊果酸和鹅去氧胆酸的结合能分别为-15.1、-10.9、-8.2 kJ/mol，而瑞德西韦、氯喹、法匹拉韦、瑞托那韦和利巴韦林的结合能分别为-10.3、-6.7、-4.9、-8.0、-6.4 kJ/mol。SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒，RdRp是催化RNA模板复制的重要酶，它的复制由病毒非结构蛋白的多个亚单位复制和转录复合物介导，核心RNA依赖的单链RNA聚合酶依赖于病毒编码的辅助因子nsp7和nsp8这2个单位来实现最佳功能[33-34]。本研究进一步将麦角胺、熊果酸、鹅去氧胆酸、瑞德西韦、氯喹、法匹拉韦、瑞托那韦和利巴韦林与SARS-CoV-2 RdRp进行分子对接发现，麦角胺、熊果酸、鹅去氧胆酸的结合能分别为-15.9、-14.6、-11.9 kJ/mol，而瑞德西韦、氯喹、法匹拉韦、瑞托那韦和利巴韦林的结合能分别为-10.4、-7.4、-6.7、-9.5、-8.1 kJ/mol。六神胶囊核心化合物结合能均低于以上几个化学药物的结合能，说明六神胶囊治疗COVID-19应有较好的疗效。麦角胺[35]、熊果酸[36]和鹅去氧胆酸[37]等核心化合物可能是六神丸胶囊治疗COVID-19的潜在物质基础。

综上所述，本研究通过采用网络药理学和分子对接相结合的方法，揭示六神胶囊治疗COVID-19可能的潜在物质基础和作用机制。从人工牛黄、雄黄、蟾酥、冰片和麝香5种主要中药中筛选出132种有效成分，并根据系统药理学原理，鉴定出靶点(PTGS2、ESR1、PLA2G1B和PTGS1)和关键途径(白介素、cGMP-PKG通路等)与治疗COVID-19密切相关。结合分子对接技术将复方中活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2以及SARS-CoV-2 RdRp的结合能进行了研究，初步揭示六神胶囊治疗COVID-19可能作用机制。