张志博，刘义明，王玉凤，张向阳，刘欣彤，王宏磊，徐 飞，路永强，陈孝杰，李秀波

(1.中国农业科学院饲料研究所 国家饲料中药物基准实验室，北京 海淀 100081；2.北京市畜牧总站，北京 朝阳 100029)

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)能引起对猪的高度接触性致死性传染病，即猪瘟(Classical swine fever,CSF)[1]，严重危害我国养猪业，是我国政府计划消灭的重大动物传染病之一。目前我国养猪模式多样化，规模各异，各猪场的生物安全等级也不尽相同，因此在猪瘟疫情防控方面，面临着严峻挑战[2]，生物安全防控是猪场防疫最直接的方式，采用有效的消毒剂是猪场的生物安全防控重点措施[3]。

二氧化氯消毒剂是被世界卫生组织(WHO)列为A1级安全高效消毒剂，其消毒具有广谱性、高效性和安全性[4]。目前国内外关于二氧化氯对病毒的灭活效果评价多集中在脊髓灰质炎病毒、流感病毒等病毒，如孙荣芳等[5]评估了二氧化氯对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、单纯性疱疹病毒Ⅰ型和腮腺炎病毒等6种病毒的灭活作用；Ogata N等[6]通过小鼠感染试验评估了二氧化氯对甲型流感病毒的灭活效果。但二氧化氯对猪瘟病毒的杀灭效果评价较少，导致二氧化氯应用于猪场消毒时缺少参考依据，在临床应用时具有盲目性。因此本试验采用免疫荧光法和悬液定量杀灭试验，测定了一种二氧化氯溶液对Thiveral株猪瘟病毒的杀灭效果，并选取市面上使用的二氧化氯粉剂进行消毒效果比较，以期为二氧化氯对猪瘟病毒的消毒标准提供参考与理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试消毒剂 二氧化氯溶液：中国农业科学院饲料研究所提供，批号:190401；二氧化氯粉剂：张家口市绿洁环保化工技术开发有限公司，批号:20181025。

1.2 细胞与毒株 猪瘟病毒Thiveral株，购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要试剂 抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗体，货号:F9006-2 mL，购自Sigma公司；Triton X-100，购自Sigma公司；PBS缓冲液、MEM培养基、牛血清和青、链霉素，均购自上海阿拉丁生物科技有限公司；五水合硫代硫酸钠，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 主要溶液配制 中和剂：含0.5%硫代硫酸钠PBS溶液；标准硬水：每1 L去离子水中含0.304 g的无水氯化钙和 0.139 g带结晶水的氯化镁；细胞生长培养液：含青、链霉素和10%牛血清的MEM培养基；细胞维持培养液：含青、链霉素和2%牛血清的MEM培养基。

1.5 主要仪器 荧光显微镜，上海蔡康光学仪器厂出产；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；ZWYR-D2403型恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；二氧化碳培养箱，苏州威尔试验用品有限公司。

1.6 PK-15细胞制备 取出冻存的PK-15细胞，置37 ℃水浴迅速解冻。室温1 000 r/min离心3 min，弃去上清。用生长培养液将细胞重悬后转移至75 cm2培养瓶中，并补加适量生长培养液，置于含5% CO2的37 ℃ 培养箱培养36～48 h。待细胞长满单层时，弃掉培养液，用PBS漂洗后加入适量胰酶，置于37 ℃消化2～3 min，轻拍瓶壁使细胞脱落。加入生长培养液，用移液器轻轻吹打使细胞分散，形成均匀的细胞悬液。接种于75 cm2细胞培养瓶中，补加生长培养液适量，置于含5% CO2的37 ℃ 培养箱培养，每日观察，待细胞长满单层时，可用于试验。

1.7 Thiveral株猪瘟病毒液的制备 取冻存的猪瘟病毒Thiveral株置于37 ℃水浴迅速融化；按10%的体积接种已经长满单层PK-15细胞75 cm2培养瓶，置于含5% CO2的37 ℃ 培养箱中吸附1 h，期间每隔10～15 min晃动1次细胞瓶，使全部细胞被浸润，防止细胞因干燥死亡；加入适量细胞维持液于75 cm2细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2温箱中放置72 h；采用免疫荧光抗体试验(FAT)检测，当细胞出现亮绿色荧光时，表明病毒培养成功；然后反复冻融3次，使宿主细胞破碎，以释放病毒，经6 000 r/min离心15 min，保留上清，上清液即为所需的病毒悬液，将病毒悬液分装。取3支病毒悬液，按Reed-Muench法计算该病毒滴度，病毒滴度达105.5TCID50/0.1 mL，-80 ℃保存备用。

1.8 中和剂试验

1.8.1 消毒剂、中和剂、中和产物对PK-15细胞的影响 参照2002年版《消毒技术规范》，主要目的是评估消毒剂、中和剂及中和产物(中和剂+消毒剂)对试验用PK-15细胞的影响。以0.5%硫代硫酸钠PBS溶液作为中和剂，消毒剂用无菌硬水稀释为最大试验浓度75 mg/L，试验在(20±2)℃下进行。分为4组，第1组：中和剂；第2组：中和产物(中和剂+消毒剂)；第3组：消毒剂；第4组：细胞对照[7]。

1.8.2 消毒剂、中和剂、中和产物对病毒的影响 参照2002年版《消毒技术规范》，主要目的是评估消毒剂、中和剂及中和产物(消毒剂+中和剂)对试验用病毒滴度的影响。以0.5%硫代硫酸钠PBS溶液作为中和剂，消毒剂用无菌硬水稀释为双倍最大试验浓度150 mg/L，试验在(20±2)℃下进行，试验分为6组，第1组：病毒悬液+消毒剂；第2组：(病毒悬液+消毒剂)+中和剂；第3组：(标准硬水+病毒悬液)+中和剂；第4组：(消毒剂+中和剂)+病毒悬液；第5组：标准硬水+病毒悬液；第6组：不接毒细胞对照[7]。

1.9 病毒灭杀试验 参照2002年版《消毒技术规范》，评价消毒剂在不同浓度下，分别作用不同时间，对Thiveral株猪瘟病毒灭活效果。有机干扰物是含3%牛血清的PBS溶液，消毒剂用标准硬水分别稀释为试验可用浓度，设置2个时间梯度(3 min和5 min)。将0.5 mL病毒悬液和0.5 mL有机干扰物混匀，加入消毒剂4 mL，使混合液中消毒剂有效物质浓度含量分别维持在6.25、12.5、25 mg/L和50 mg/L，20 ℃水浴作用至预定时间，取上述消毒产物0.1 mL加中和剂0.9 mL，混匀作用10 min。测定病毒滴度。用无菌硬水代替消毒剂作为阳性对照，进行上述试验[7]。

病毒灭活率=(阳性对照组病毒滴度-试验组病毒滴度)÷阳性对照组病毒滴度×100%

2 结果

2.1 消毒剂、中和剂、中和产物对PK-15细胞的影响分析 试验结果见中插彩版图1，将0.5%硫代硫酸钠的PBS作为中和剂，作用试验细胞3 h，在光学显微镜下观察，显示细胞形态正常，生长状况良好。将2种消毒剂与中和剂形成的中和产物作用试验细胞3 h，均显示细胞形态正常，生长状况良好。试验结果表明，中和剂与消毒剂和中和剂形成的中和产物对细胞生长无影响，与对照组相比并无明显差异。

2.2 消毒剂、中和剂、中和产物对病毒的影响分析 试验结果见表1，以0.5%硫代硫酸钠PBS溶液作为中和剂中和这2种供试消毒剂，均显示第1组无病毒生长，第2组与第1组相近且病毒含量远小于3、4、5组，3、4、5组的LogTCID50相近，第6组试验细胞生长正常且无细胞病变。结果表明，此中和剂可有效中和这2种供试消毒剂对Thiveral株猪瘟病毒的杀灭作用，且中和剂与中和产物对Thiveral株猪瘟病毒和试验细胞无明显影响。因此，以0.5%硫代硫酸钠PBS溶液作为中和剂符合要求。

表1 中和剂鉴定试验结果

2.3 病毒灭杀试验分析 如表2所示，有效浓度为25 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，对Thiveral株猪瘟病毒灭活率达100%，灭活效果达标；如表3所示，有效浓度为25 mg/L的二氧化氯粉剂溶解液作用3 min，对Thiveral株猪瘟病毒灭活率达100%，灭活效果达标；试验结果表明，二氧化氯溶液对Thiveral株猪瘟病毒杀灭效果良好，且与二氧化氯粉剂对Thiveral株猪瘟病毒杀灭效果相似，两者浓度为25 mg/L时，均能杀灭Thiveral株猪瘟病毒。

表2 二氧化氯溶液对Thiveral株猪瘟病毒灭活效果

表3 二氧化氯粉剂对Thiveral株猪瘟病毒灭活效果

3 讨论

本试验的主要目的是研究一种二氧化氯溶液对猪瘟病毒的灭杀效果，为二氧化氯对猪瘟病毒的消毒标准建立参考与理论依据，对二氧化氯类消毒剂应用于猪场消毒提供指导建议。Thiveral株猪瘟病毒是中国兽医药品监察所提供的一种标准试验性病毒，在猪瘟类病毒中有普遍的代表性，且具有繁殖力强、培养时间短等优点，能够有效地缩短试验周期，因此试验使用Thiveral株猪瘟病毒作为消毒对象[8]。采用精确的病毒检测方法是提高试验准确性与科学性的前提，目前国际上对病毒含量检测方法众多，并无统一标准，主要的方法有细胞感染法[9]、鸡胚感染法[10]、动物感染法[11]、荧光定量PCR[12]、RT-qPCR法[13]及免疫学等方法，本试验将细胞感染法与免疫荧光法相结合，利用灭活前后的Thiveral株猪瘟病毒分别感染PK-15细胞，然后使用免疫荧光法测定PK-15细胞的病变反应，此法能够精确的测定出猪瘟病毒含量。

中和剂试验证明了中和剂与中和产物对试验细胞无影响，且对病毒滴度也没有影响，可以进行病毒灭杀试验。病毒灭杀试验表明，浓度为12.5 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，对Thiveral株猪瘟病毒灭活率达96.84%，当作用时间延长至5 min，对该病毒灭活率提高到99.11%；当浓度提高到25 mg/L时，作用3 min，对该病毒灭活率达100%，能完全杀灭病毒。有效浓度为12.5 mg/L的二氧化氯粉剂溶解液，对Thiveral株猪瘟病毒作用3 min时，灭活率达99.07%，延长作用时间至5 min，对该病毒灭活率上升至99.25%；当浓度提高到25 mg/L时，作用3 min，对该病毒灭活率也可达100%。试验结果表明，二氧化氯溶液对Thiveral株猪瘟病毒杀灭效果良好，且与二氧化氯粉剂对Thiveral株猪瘟病毒杀灭效果相近，两种消毒剂对该病毒的灭活效果相近的原因可能是由于两者的有效成分均为二氧化氯。本试验结果表明，二氧化氯对猪瘟病毒具有良好的灭活效果，对二氧化氯类消毒剂应用于猪场消毒具有指导意义。

作为理想的消毒剂应该满足廉价、低毒和高效这三大基本要素。二氧化氯作为国际公认的高效、无毒和安全的绿色消毒剂，广泛应用于食品工业、制药、畜牧、公共环境等多领域，具有灭菌、消毒、防霉、保鲜等用途[14]，二氧化氯溶液具有无残留、稳定性好、价格低等优点，有广阔的应用前景。