庄旭东 王心睿

神经退行性疾病，是由于大脑和脊髓的神经元或其髓鞘缺失，随着时间的推移而恶化，导致运动（共济失调）或精神（痴呆）功能问题，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、多发性硬化（multiple sclerosis，MS）和肌萎缩性脊髓侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等疾病，大部分不可治愈，造成了巨大的社会负担[1-2]。

一直以来，小鼠是研究神经退行性疾病的常用模型，因为不能完全模拟人类神经退行性疾病的真实情况或在神经退行性病变的治疗中发挥作用，所以不能广泛用于神经退行性疾病研究[3]。非人灵长类和人同属哺乳纲的灵长目，不论从基因组到神经解剖学，还是从免疫系统到行为学等方面，都与人类高度相似，是研究人类神经退行性疾病发病机制和治疗方法的关键动物模型[4-6]。

众所周知，自然界中斑马鱼的胚胎是透明的，有利于科学研究[7-8]。绝大多数生物由于内、外源性色素的存在、组织成分不同及其不均匀分布引起折射率的差异，生物组织高度不透明。有研究发现，啮齿类动物研究中开发的组织透明化技术，适用于非人类灵长类动物[9-10]。非人灵长类动物经组织透明化技术处理，结合光学成像、荧光标记和数据整理与分析，理论上不仅能从立体上完整观察非人灵长类神经退行性疾病动物模型，获得高分辨率的器官、组织和细胞的结构信息；还能从全局研究完整非人灵长类神经退行性疾病动物模型的宏观、介观和微观的生命现象和生物活动规律[11-12]。

一、组织透明化

组织透明化是通过不同化学试剂的组合使用结合浸泡、灌注、电泳等各种渗透方式，脱脂、脱色、脱钙和扩张，改变折射系数（refractive index，RI），使得样品的RI 与成像介质的RI趋近一致，减少光线折射，增加镜下视野亮度，提高组织器官样本透明度，最后实现3D 成像，立体观察完整的生物体[13]。

目前组织透明化有3 种主要的方法：疏水法、亲水法和水凝胶法。疏水法：主要包括溶剂清除器官的三维成像（threedimensional imaging of solvent cleared organs，3DISCO）、极限3DISCO、免疫标记的3DISCO（immunolabelling-enabled 3DISCO，iDISCO）和重链抗体的可变域3DISCO（variable domain of heavy-chain antibodies 3DISCO，vDISCO）；依赖于组织的完全脱水，使用有机溶剂进行脱水、脱脂和RI 匹配，可以快速有效透明组织且易于成像和保存，但可能收缩组织和漂白荧光蛋白。亲水法：主要包括基于尿素的透明技术Sca/e、深部脑成像（see deep brain，SeeDB）、清晰且无阻碍的大脑或整体成像方法（clear,unobstructed brain or body imaging cocktails and computational analysis，CUBIC）、基于尿素和山梨醇的透明方案Sca/eS 和SeeDB2；基于水溶性溶液，比疏水法具有更高的生物安全性和相容性，过程包括脱色、脱脂和RI 匹配，但可能会扩张组织和需要更长的孵育时间。水凝胶法：主要包括清晰脂质交换丙烯酰胺杂交精细成像相容性组织水凝胶法（clear lipid-exchanged acrylamide hybridized rigid imagingcompatible tissuehydrogel，CLARITY）、原位灌注辅助药物释放透明法、X 倍扩展CUBIC、环氧化物交联保护快速透明法、通用型组织染色成像法（CUBIC-HistoVIsion）和小胶束介导的人体器官透明化和标记[14-15]；使用单体和引发剂分子或聚环氧化物合成凝胶，进行脱脂和RI 匹配，既可多重标记，又保留着高分子蛋白、DNA 和RNA，还可使组织扩张数倍，但要求更长的孵育时间或是辅助处理设备。

这些组织透明化方法的选择使用，要结合生物体组织器官的物理特性和实验目的综合考虑[16]。

二、组织透明化应用在非人灵长类神经退行性疾病

神经系统的复杂性和异质性导致研究进程缓慢，其中神经退行性疾病的发生发展涉及多种不同的细胞类型、错综复杂的神经回路和信号通路，组织透明化初步实现啮齿类与非人灵长类动物的大脑3D 成像，与大体解剖和二维切片相比，更有利于研究神经退行性疾病的复杂性，有望为人类神经退行性疾病的机制研究和治疗提供有力支持。

（一）AD

由于影响AD 发展的遗传因素和环境因素非常复杂，AD的发病机制至今尚未得到充分的研究[17]。细胞外老年斑和细胞内神经纤维缠结是AD 的2 个病理特征[18]。细胞外老年斑主要存在于海马体和新皮质，是Aβ 在神经元之间的异常积累和聚集而成，而神经纤维缠结与tau 蛋白的过磷酸化有关，从海马状突起扩散到大脑的不同区域中，破坏脑功能，引起患者的认知能力下降和记忆丧失[19-20]。

Ando 等[21]比较了CLARITY、Sca/e、SeeDB 和3DISCO 等组织透明方法，认为CLARITY 更适合于立体观察AD 患者大脑皮层中Aβ 分布和聚集在神经元周围的变性的tau 蛋白。Liebmann 等[22]借助iDISCO 立体观察Aβ 在AD 模型小鼠大脑中的分布和磷酸化tau 的扩散方式，分析斑块的形成和分布。Vints 等[23]通过CUBIC 结合荧光染料可使单个神经元3D成像，观察AD 小鼠中Aβ 在神经元的不同阶段所引起的形态变化。现有的非人灵长类AD 模型建立方法很多，开发转基因非人灵长类AD 模型或接种AD 患者的大脑匀浆，在药物开发和免疫疗法研究中能够发挥更好的作用[24-26]。通过非人灵长类AD 动物模型结合组织透明化技术，有利于观察AD神经元的退行性病变和Aβ、tau 蛋白等之间的演变过程，阐明AD 的潜在发病机制和药物靶点。

（二）ALS

ALS 的病因、病理并不明确，主要累及大脑皮质运动区锥体细胞和脑神经核、脊髓前角细胞，主要病理改变是TDP-43蛋白在细胞质积累、运动神经元的减少和残存神经元的变性，主要临床表现为延髓支配四肢、躯干肌肉的无力和萎缩，最终恶化导致呼吸肌无力而窒息死亡[27-29]。

Hruska 等[30]将CUBIC 与受激发射减损显微镜相结合，3D成像观察到小鼠脊髓树突细胞与突触前后的蛋白的量有关。Morawski 等[31]应用CLARITY 在人脑样本，3D 成像观察了大脑皮层介观现象、皮质神经元形态和髓鞘纤维分布。Lee等[32]将ACT-PRESTO 应用在人类脊椎样本，实现脊椎3D 成像的结构观察。非人灵长类ALS 动物模型在各方面优于啮齿类动物模型，特别是在研究TDP-43 蛋白错误积累与错误定位和相关蛋白质包涵体方面[33]；在非人灵长类ALS 动物模型大脑中观察到caspase-4 调节TDP-43 蛋白在胞质中的错误定位，而且与啮齿类动物模型有所不同[34]。非人灵长类ALS动物模型与组织透明化技术结合，易于观察ALS 中运动神经元的数量变化、变性特点和TDP-43 蛋白的错误积累和错误定位，从三维可视化角度阐述ALS 的发生发展机制。

（三）MS

MS 是一种进展性、炎症性脱髓鞘病，累及中枢神经系统多个部位，不同部位发病引起不同的临床表现，而且反复发作。病理特点是皮质脱髓鞘和神经-轴索、突触的缺失，靶点是丘脑、海马等灰质结构。主要临床表现为反复发作的脑、脊髓和视神经损伤。其中实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一种广泛应用于MS 模型的临床前研究新疗法和潜在发病机制[35-37]。

Erturk 等[38]借助3DSICO 研究和测定小鼠脊髓胶质细胞的数目变化，分析脊髓伤后神经胶质细胞反应特点和轴突再生轨迹。Spence 等[39]借鉴改良的CLARITY 方法，研究表明MS灰质萎缩与轴突膨大的数目有关，提供髓鞘再生的治疗靶点和策略。有研究发现非人灵长类EAE 动物模型可以弥补啮齿类动物EAE 模型模型与MS 患者之间的差异，观察到非人灵长类MS 动物模型白质和灰质中脱髓鞘情况可以初步判断病情进展，辅助诊断和治疗[40-41]。结合组织透明技术观察非人灵长类MS 动物模型中枢神经系统多个部位的脱髓鞘和神经元、轴突的缺失现象，对研究MS 的整体水平十分重要。

（四）PD

PD 是一种与α-突触核蛋白基因突变有关的神经退行性疾病，特征性病理改变为黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成，导致纹状体区多巴胺递质减少，从而患者出现临床上最经典的症状：静止性震颤和肢体僵硬[42-44]。

Liu 等[45]应用CLARITY 方法、3D 成像观察和分析PD 患者组织和小鼠大脑的路易小体形态及其空间定位和单突触多巴胺能神经元，Menegas 等[46]凭借CLARITY 方法可视化观察位于小鼠脑中的纹状体、皮层、杏仁核的单突触多巴胺能神经元，研究多巴胺神经回路机制。Morissette 和Di Paolo[47]认为非人灵长类PD 动物模型是实验减少或抑制过表达的α-突触核蛋白是PD 关键的治疗靶点的关键模型。Seo 等[48]认为1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导引起黑质细胞的大量缺失和存在类路易小体包涵体的慢性非人灵长类PD 动物模型，适合于行为学评价。组织透明化结合非人灵长类PD 动物模型和透明化技术，对阐述多巴胺的功能及其对神经元的作用机制更有利。

三、总结与展望

组织透明化技术在非人灵长类中的应用已有报道，表明其应用于研究非人灵长类动物的神经退行性疾病具有可行性[9-10]。但是，组织透明化技术存在以下技术局限性：（1）荧光蛋白的淬灭。在透明过程中，使用的化学试剂难免会加速荧光蛋白的淬灭，不利于光学成像。因此如何在透明过程减少荧光信号的淬灭、保留蛋白和核酸等的抗原性，还需要进一步的研究；（2）样本的变形。在透明过程中，化学试剂的作用影响样本的理化性质，比如亲水法和水凝胶法会引起组织扩张，疏水法则会导致组织皱缩，改变了样本原有的结构信息；（3）光学成像。如何实现样品大小、信噪比、扫描速度、成像深度和分辨率的高效、灵活配置，适用透明化的完整大型生物体的成像，需要多学科合作。当然亟需改进的方面还有很多，比如透明的过程繁琐耗时和试剂昂贵不利于推广使用，透明化组织的保存、数据整理与分析、有机溶剂的毒害性等。

综上所述，通过对非人灵长类动物神经器官透明化，或将实现3D 观察和分析非人灵长类结构完整的神经细胞；通过对非人灵长类动物的全身组织器官透明化，进行高通量的3D 成像，有望应用于药物开发；通过对非人灵长类动物的组织样本透明化，进行3D 成像，有利于发现更多的疾病相关的细胞，提高实验诊断的敏感性和准确性。组织透明化技术应用于非人灵长类退行性疾病动物模型的研究，引导人们系统、整体去获取生物体结构和功能信息，转化为临床应用，或将解决许多疑难杂症。

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