林 雯，徐国兴

0引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类存在于骨髓间质组织中的成体干细胞，来源广泛、易培养,可高效扩增,进行自体移植无伦理争议及免疫排斥，是移植治疗病变视网膜的种子细胞。近年来，干细胞治疗视网膜病变的研究和试验已获得一定的进展，其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最引人注目。MSCs是来源于中胚层的成体干细胞，其视网膜保护机制主要有：(1)细胞替代治疗：MSCs在特定微环境中可被诱导分化为视网膜细胞，在一定程度上起到替代作用[1]，从而达到治疗目的；(2)旁分泌作用：MSCs可以分泌睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等多种神经营养因子，调节周围受损组织的微环境，激活靶器官的修复机制，抑制视网膜细胞凋亡[2]；(3)调控血管生成的微环境，抑制新生血管的大量产生[3]；(4)促进视网膜形成新的突触连接和信号转导，提高视功能[4]；(5)MSCs还具有免疫调节能力，抑制炎症因子的释放[5-6]，自体或异体移植后无免疫排斥反应，并且在体内移植后归巢至受损靶组织[7]。Tracy 等[8]利用基因修饰的MSCs过表达可溶性溶酶体酶来治疗因PPT-1基因突变引起的溶酶体酶缺陷性视网膜变性，并未观察到MSCs在玻璃体发生增殖或侵袭，说明基因修饰的MSCs在眼内长期分泌所需蛋白治疗视网膜变性是一种安全可靠的方法。还有其他研究表明MSCs是良好的基因载体[9-11]。由此可见，基因修饰的MSCs在视网膜病变研究中展现出广阔的应用前景。本研究拟通过腺病毒载体修饰BMSCs，使其过表达CNTF，为视网膜病变的体外研究提供新途径。

1材料和方法

1.1材料大鼠骨髓间充质干细胞(广州赛业)，大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液(广州赛业)，0.25%胰酶(美国Gibco)，293A细胞(上海汉恒生物)，载体pHBAd-MCMV-GFP(上海汉恒生物)，大肠杆菌菌株DH5α(北京Tiangen)，限制性内切酶(美国Fermentas)，T4连接酶(美国Fermentas)，质粒DNA小、大量抽提试剂盒(北京康为世纪)，凝胶回收试剂盒(美国Axygen)，琼脂糖、琼脂粉(法国Biowest)，DNA ladder(美国Fermentas)，一次性培养瓶/培养皿(美国Corning)，ELISA试剂盒(英国Abcam)。PCR仪(美国Applied Biosystems)，紫外分光光度计(美国Beckman)，DNA电泳仪(美国Applied Biosystems)，凝胶分析仪(美国Bio Rad)，荧光显微镜(日本奥林巴斯)，酶标仪(美国Molecular Devices)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨髓间充质干细胞的培养及传代BMSCs以5×105个/皿密度接种于10cm培养皿，每盘加入完全培养液10mL，置于37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养，每2d进行换液，当细胞密度超过80%时进行传代。吸除培养皿内旧培养液，用PBS洗涤2遍，加入0.25%胰酶1mL，放入培养箱内孵育1min后，把培养皿放置在倒置显微镜下进行观察，发现胞质回缩变圆时，应立即用等量完全培养液终止消化，反复吹打，形成细胞悬液，以1∶2传代接种在新培养皿内，传代后间隔2d换液，直至细胞生长至80%汇合后，继续传代，如此反复，取第3代细胞用于后续实验。

1.2.2腺病毒包装和扩增及纯化(1)目的基因片段的获取：根据Genebank上大鼠CNTF基因(NM_013166.1)编码区(CDS)，委托基因公司化学合成目的基因，pHBAd-MCMV-GFP载体用BamH I和EcoR I双酶切(酶切体系含载体、BamH I、EcoR I、10×buffer和水)，载体酶切完成后胶回收。(2)合成的序列载体用BamH I和EcoR I双酶切获得CNTF片段，目的片段与载体连接，酶切完成后胶回收。(3)转化感受态细胞：事先准备好用于包装病毒的293A细胞和病毒质粒，转染每个直径为6cm的培养皿，complex成分：穿梭质粒2μg，p-BHG(delta)E1,3 cre 4μg。Opti MEM在37℃水浴中预热，Lipofiter TM转染试剂恢复至室温后使用，使用前摇匀，抗性:Amp，37℃培养过夜。转染后6h换新鲜培养液。(4)病毒的收集：病毒收集前观察病毒空斑是否形成，为限制病毒的扩散及空斑更好的形成，在培养液中加入琼脂糖，空斑形成后连着琼脂糖一起将空斑挑起，放入新鲜培养基中过夜。转化后的CNTF平板挑菌，37℃，250r/min摇菌14h，菌液进行PCR鉴定，并将阳性克隆菌液送基因公司测序。(5)病毒的扩增：将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。(6)病毒的纯化：采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl梯度的制备方法如下：加入2.0mL密度为1.40g/mL的CsCl溶液，然后缓慢加入3.0mL密度为1.30g/mL的CsCl溶液，再加入5mL的病毒悬浮液，透析袋使用前用10mmol/L的EDTA-Na2煮沸10min，20000r/min室温离心2h，收集密度在1.3～1.4g/mL的病毒条带至透析袋中，配制透析缓冲液：50g蔗糖，10mL 1mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2mL 1mmol/L MgCl2定容至1L，在透析缓冲液4℃搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。(7)病毒重悬和保存：500μL的PBS重悬病毒沉淀，置于-80℃保存备用。

1.2.3腺病毒感染BMSCs取第3代生长良好的BMSCs，以2×104个/mL的密度接种于24孔板中，每孔加入0.5mL，培养18h后细胞融合率约50%～60%，每孔更换为新鲜完全培养液1mL，调整腺病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10，加入稀释好的腺病毒液，轻晃混匀，继续感染7h后，PBS洗3遍，更换为新鲜完全培养液。

1.2.4 ELISA检测细胞上清液中CNTF分泌水平调整BMSCs密度，按2×104个/孔的密度接种于6孔板，24h后细胞约为5×104个/孔，更换不含青霉素-链霉素和胎牛血清的新鲜培养基，1mL/孔；设置三组：空白对照组(未转染腺病毒组)、GFP-BMSCs组(空载腺病毒感染，病毒滴度2×1010TU/mL，MOI=200)、CNTF-BMSCs组(CNTF腺病毒感染，病毒滴度1010TU/mL，MOI=200)，感染7h后PBS洗3次，1mL/孔全量更换培养液，更换为含FBS和青霉素-链霉素的大鼠BMSCs完全培养液，1、2、3d后收集各组细胞上清液，2000r/min离心20min，取上清液，按照ELISA试剂盒操作说明书测定各组上清液中CNTF的蛋白浓度。比较三组上清液中CNTF的蛋白浓度。

2结果

2.1合成的目的基因序列合成的目的基因为含有CNTF序列的pHBAd-MCMV-GFP载体，ggatcc及gaattc分别为BamH I和EcoR I酶切位点，目的基因序列如下：

ggatccATGGCTTTCGCAGAGCAAACACCTCTGACCCTT

CACCGCCGGGACCTCTGTAGCCGTTCTATCTGGCTAGCAA

GGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTATGGAATCTTA

TGTAAAACATCAGGGCCTGAATAAAAATATCAACCTTGAC

TCAGTGGATGGTGTACCAGTGGCAAGCACTGATCGTTGGA

GTGAGATGACTGAGGCAGAGCGACTCCAAGAGAACCTCC

AGGCTTACCGTACCTTCCAAGGGATGTTAACCAAGCTCTT

AGAAGACCAGAGAGTACATTTCACCCCAACTGAAGGTGA

CTTCCATCAGGCAATACATACTCTTATGCTCCAAGTTTCT

GCCTTTGCCTACCAGCTAGAGGAGTTAATGGTGCTTCTGG

AACAGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGATGCCTG

CCACAGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTAT

GGGGCTTGAAGGTCCTTCAAGAGCTCTCACAGTGGACTG

TGAGGTCTATCCATGACCTTCGTGTCATTTCTTCTCATCA

GATGGGAATCTCAGCACTTGAGAGCCATTATGGGGCCAA

AGATAAGCAGATGTAGgaattc。

2.2含有CNTF的pHBAd-MCMV-GFP载体酶切回收结果含有CNTF的pHBAd-MCMV-GFP载体酶切后得到约5500bp大小的产物，如图1 Lane2～5所示，与pHBAd-MCMV-GFP载体大小一致。

图1 pHBAd-MCMV-GFP载体胶回收结果 Lane1：DNA Marker，Lane2～5：pHBAd-MCMV-GFP载体。

2.3合成的序列载体用BamH I和EcoR I双酶切获得CNTF片段并且酶切完成后胶回收合成的序列用BamH I和EcoR I进行双酶切，获得约5500bp及600bp大小的产物(图2，Lane1)，分别与载体和CNTF大小一致，说明目的基因构建成功。

图2 合成载体双酶切胶回收结果 Lane1：CNTF合成载体双酶切产物,上方为GV287载体，下方为CNTF基因；Lane2：DNA Marker。

2.4 CNTF单克隆PCR鉴定结果用通用引物对CNTF单克隆进行PCR检测，得到的目的基因比CNTF大200bp左右(图3，Lane2～7)，与引物大小一致，说明CNTF单克隆构建成功。

图3 CNTF单克隆PCR鉴定结果 Lane1：DNA Marker；Lane2～7：重组载体。

2.5 pHBAd-MCMV-GFP- CNTF重组载体测序结果CNTF过表达载体测序结果：

GCGGAAGGCTCGGTCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCA

CCGTAGAACGCAGATCGAATTAAGCTTGGGCTGCAGGTCG

ACTCTAGAGGATCCATGGCTTTCGCAGAGCAAACACCTCT

GACCCTTCACCGCCGGGACCTCTGTAGCCGTTCTATCTGGC

TAGCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTATGGAA

TCTTATGTAAAACATCAGGGCCTGAATAAAAATATCAACCT

TGACTCAGTGGATGGTGTACCAGTGGCAAGCACTGATCGTT

GGAGTGAGATGACTGAGGCAGAGCGACTCCAAGAGAACCT

CCAGGCTTACCGTACCTTCCAAGGGATGTTAACCAAGCTCT

TAGAAGACCAGAGAGTACATTTCACCCCAACTGAAGGTGA

CTTCCATCAGGCAATACATACTCTTATGCTCCAAGTTTCTG

CCTTTGCCTACCAGCTAGAGGAGTTAATGGTGCTTCTGGAA

CAGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGATGCCTGCCA

CAGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTATGGGG

CTTGAAGGTCCTTCAAGAGCTCTCACAGTGGACTGTGAGG

TCTATCCATGACCTTCGTGTCATTTCTTCTCATCAGATGGG

AATCTCAGCACTTGAGAGCCATTATGGGGCCAAAGATAAG

CAGATGTAGGAATTCAGATCTGGTACCGTCGACGCGGCCG

CTCGAGCCGATATCATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGT

TATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCC

ATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC

AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTT

TCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCC

CACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG。测序结果比对显示：阳性克隆中的序列与CNTF上(NM_013166.1)的CDS区完全一致(图4，绿色标记部分)，表明克隆成功。

图4 阳性克隆的测序结果分析。

2.6各组在不同时间点上清液的CNTF蛋白浓度腺病毒转染后1、2、3d，检测三个组的CNTF蛋白浓度(表3)。结果表明，各组在不同时间点CNTF蛋白浓度差异有统计学意义(F时间=2266.250，P时间<0.001；F组间=14969.493，P组间<0.001；F组间×时间=3336.505，P组间×时间<0.001)。1、2、3d各时间点，与空白对照组相比，实验组的CNTF蛋白浓度上调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阴性对照组相比，实验组的CNTF蛋白浓度上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。在实验组内，CNTF蛋白浓度随时间延长而提高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组在不同时间点上清液中的CNTF蛋白浓度

3讨论

CNTF对视网膜的保护机制主要有：(1)直接作用于感光细胞[12-13]，阻止光感受器的变性和凋亡；(2)激活Müller细胞[14]，使之分泌保护光感受器的神经营养因子；

(3)促进谷氨酸盐转运蛋白的合成或分布，提高谷氨酸盐的处理效率，减少对视网膜神经元的兴奋毒性损伤[15]；(4)增强视网膜细胞对新陈代谢损害的抵抗力，提高视网膜的应激能力[15]。CNTF可以促进动物视细胞的存活[16]，在变性视网膜中，CNTF可以加快视锥细胞外段的更新[17]，还能抑制视网膜神经节细胞凋亡，其视网膜神经保护功能已被广泛研究。在啮齿类动物中，经玻璃体腔注射CNTF蛋白可引起Müller细胞和视网膜神经节细胞的信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化显著增加，而感光细胞的STAT3无明显改变[15, 18]。因此，CNTF也有可能是间接通过其他细胞，如Müller细胞分泌细胞因子从而保护光感受器。RPE细胞顶端存在CNTF受体复合物，提示RPE细胞可对CNTF产生应答[19]。CNTF可促进RPE细胞存活，加速光感受器的更新，促进Müller细胞分泌神经营养因子等，从而保护视网膜。综上，CNTF对视网膜的保护研究具有重要意义。

使BMSCs过表达CNTF，可通过非病毒载体和病毒载体。非病毒载体表达时间短，对细胞转染率低并且不易保存。腺病毒载体构建周期短，转染时间短且转染率高，使用方便，但不能整合到靶细胞基因组中[20]，因此适合用作短期的体外实验。慢病毒可携带较大的基因片段，并整合到靶细胞基因组中，可以在宿主内长期、高效稳定地表达[21-22]，然而合成周期较长，扩增步骤繁琐，适用于较长时间的体内实验，国内已有武晶晶等[23]利用慢病毒对BMSCs进行基因修饰，使其过表达CNTF。单纯注射或单剂量使用CNTF蛋白，药物半衰期短[24]、浓度波动较大，为使CNTF在体外高效稳定地表达，进一步研究过表达CNTF蛋白的BMSCs在体外研究中对视网膜的保护作用，我们成功构建了过表达CNTF的腺病毒，并利用病毒系统感染BMSCs，使其持续高效表达CNTF成为可能，以期为视网膜疾病的体外研究提供新思路。