陈俐静，陈卓，李娜，孙亚伟，李红波，宋雯雯，张杨，姚刚

（1新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052；2新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830011）

0 引言

【研究意义】肉牛养殖业是新疆畜牧业主导产业，新疆褐牛及其杂交牛是新疆肉牛业主导品种之一。目前，新疆褐牛及其杂种后代总存栏数约为150万头，纯种新疆褐牛占总数的 30%左右[1]。随着人们生活质量的提高，牛肉作为重要的肉食品，优质、高档牛肉供不应求[2-3]。牛肉的食用品质主要包括嫩度、多汁性和风味[4]。而影响畜肉品质的因素有很多，其中肌内脂肪（intramuscular fat，IMF），又称为大理石花纹，其含量会影响牛肉的食用品质[5-6]。高水平的 IMF含量很可能会增加油脂含量和肌红蛋白的氧化[7]，进而影响肉色。适当地提高 IMF含量，可以提高肌肉的嫩度、多汁性等食用品质[8]。因此，调控IMF的沉积成为提高肉品质的一个重要途径[9]。【前人研究进展】瘦素（leptin，LEP）基因多态性已经被作为肉牛的大理石纹、背膘厚度、嫩度、胴体重、牛肉质量评价等性状的候选基因[10]。SCHENKEL等[11]研究发现肉牛产肉率、背膘厚度和嫩度与 LEP基因显著相关。说明 LEP可作为评定肉品质及肉质脂肪沉积的指标。脂肪酸合成酶（fatty acid synthesase，FAS）在脂肪代谢中主要作用是合成长链脂肪酸，而激素敏感酯酶（hormone-sensitive lipase，HSL）则是脂肪分解的关键限速酶[12]。FAS、HSL和脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）基因mRNA表达与皮下脂肪、IMF沉积存在密切相关[13-14]。HILLER等[13]研究发现FAS、LPL和HSL基因mRNA表达与皮下脂肪、IMF沉积存在密切相关。JEONG等[14]研究了韩国肉牛16个脂肪代谢相关基因，证明FAS、LPL和HSL基因表达与IMF代谢均呈显著相关，其中LPL基因上调可增加脂肪细胞膜对脂肪酸的摄取，从而增加IMF沉积。脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid-binding protein 4，FABP4）是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白，能在脂肪细胞中沉积甘油三酯，增加IMF的含量。FABP4基因与肉牛IMF沉积、大理石纹形成密切相关[15-17]。【本研究切入点】由于新疆褐牛遗传背景复杂，其IMF沉积能力、大理石纹含量、嫩度等与脂肪代谢相关的肉品质形成机理等方面缺乏与国内外优良肉牛品种的比较研究。【拟解决的关键问题】本试验选取新疆褐牛与安格斯肉牛进行屠宰性状、肉品质及其脂代谢相关基因的比较研究，探明新疆褐牛与安格斯肉牛上述关键体脂代谢基因mRNA和蛋白表达的脂肪组织和品种差异性，为今后改善新疆褐牛的肉品质性状奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本研究动物饲养试验在新疆某集约化肉牛养殖场进行。2016年12月选取生长发育正常、健康，品种特征明显的新疆褐牛（Xinjiang brown cattle，XBC）和纯种安格斯牛（Angus beef cattle，ABC）3月龄断奶公犊各7头，单独分栏组群，专人负责，按照该场统一饲养管理方式饲养，于2018年9月达到24月龄后进行屠宰。

1.2 仪器设备与试剂

仪器设备：背膘测定仪（Mylab Touch vet）；显微镜（NIKON）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A）；半自动切片机（LEICA CM3050 S）；Motic显微成像系统（Advance 3.5软件）；光学显微镜BA400（Motic实业集团有限公司）；离心机5415D（Eppendrof）；PCR仪PTC-225（Bio-Rad）；凝胶成像系统CBC/UVP I-D001（CapitalBio）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）；超声波细胞破碎仪JY92-2D（宁波新芝生物科技股份有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器LDZX-30KBS（上海申安医疗器械厂）；恒温培养振荡器TS-2102C（上海智城分析仪器制造有限公司）；酶标仪DG5031（上海齐欣有限公司）。

试剂：苦味酸购自台山粤桥试剂有限公司；固体石蜡、苏木素、尹红、中性树胶均购自中国上海标本模型厂；mirVana miRNA Isolation Kit、r-Taq 酶、cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix、Micro Amp Optical 96-well Reaction Plate、Micro Amp Optical Adhesive Covers 4311971均购自abm（Master Mix-EL）公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白变性缓冲液、SDS-PAGE凝胶试剂盒、化学发光显色液均购自 Thermo Fisher公司；小鼠抗beta-actin单克隆抗体ab6276、小鼠抗LPL单克隆抗体ab21356、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠ab97240均购自Abcam公司；大鼠抗FAS单克隆抗体05-351购自 Merck Millipore公司；兔抗 HSL单克隆抗体NBP1-76735购自Novus公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠abs20031购自Absin公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔111-305-003购自Jackson公司。

1.3 方法

1.3.1 采样 前述24月龄XBC和ABC各7头试验牛在屠宰前一天，采用背膘仪活体测定背膘厚度、眼肌面积和肌内脂肪参数，并进行活体称重，记录耳标号。试验牛经待宰圈12 h禁食后，进入屠宰车间自动化屠宰，测定胴体及产肉性状。并采集背最长肌和皮下脂肪等相关样品液氮保存后于实验室进行后续指标测定。

1.3.2 胴体性状

胴体重：除去头、皮、尾、蹄、内脏所余体躯重量；

净肉重：胴体除去骨胳之后的净肉和脂肪的重量；

屠宰率=胴体重/活重×100%；

净肉率=净肉重/活重×100%；

肉骨比=胴体净肉重/骨骼重×100%。

用背膘仪测量肌间脂肪、背膘厚度、眼肌面积。

1.3.3 肉品质性状 利用色度仪对每块背最长肌测定肉色，分别记录肉样的亮度（L*）值、红度（a*）值和黄度（b*）值；IMF根据《食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）测定；水分根据《食品中水分的测定》（GB 2019.3—2016）测定；灰分根据《食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）测定；剪切力根据《肉嫩度的测定 剪切力测定法》（NY/T 1180—2006）测定。

1.3.4 肌肉及皮下脂肪形态学测定 肌肉及皮下脂肪制备常规石蜡切片，H.E染色[18]。利用 Motic Advanced 3.5显微成像系统观察并测量肌肉及皮下脂肪，借助FastStone Capture软件[19]计算细胞单位面积及数量。

1.3.5 脂代谢相关基因的mRNA表达

（1）组织样本总RNA提取

1）在液氮预冷砂浆中取30—50 mg最长的肌肉样品，充分研磨成液氮，加入1 mL Trizol，混匀后冰上静置5 min裂解并转入新EP管。

2）加入0.2 mL预冷过的氯仿，混匀15—30 s，冰上静置2—3 min。

3）4℃离心，12 000g×15 min，分层。

4）吸清液400—500 μL并加入0.5 mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-80℃静置30 min。

5）4℃离心，12 000g×15 min。

6）弃上清，加入75%乙醇（冰冷）1 mL，振摇，4℃离心，12 000g×5 min。

7）弃上清，短暂离心，弃剩余上清。

8）加入适量（20—30 μL）DEPC（Rnase Free）H2O溶解RNA，测浓度，储存-80℃。

（2）基因组消化和反转录 基因组消化的反应体系：1 µg 总 RNA，2 µL 5×gDNA buffer，42℃、3 min。

反转录用cDNA第一条链合成试剂盒反转录1 µg总RNA成cDNA，反应体系：2 µL 10×Fast-RT Buffer，2 µL FQ-RT Primer Mix，1µL RT Enzyme Mix，5 µL RNase-Free Water，加入消化产物总体积20 µL，反应条件：42℃、15 min，95℃、3 min，-80℃保存。

（3）荧光定量PCR引物 使用DNAMAN软件设计引物[20]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，信息见表1。

（4）检测 LEP、FAS、FABP4、HSL、LPL基因转录水平测定 利用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒和Quant Studio Flex Real Time PCR system仪器进行相对定量。反应体系如表2。

表1 引物信息Table 1 Primer information

表2 荧光定量PCR反应体系Table 2 RT-PCR reaction system

反应条件：95℃预变性 10 min，95℃、15 s，95℃、1 min，40个循环。每个试验组设定3个重复，扩增结束用ABI 7500 Fast软件收集CT值并用2-△△CT分析目的基因表达水平，用内参基因Beta-actin矫正。

（5）实时荧光定量PCR产物电泳检测扩增特异性

取扩增产物 4 µL 与 4 μL 2×Loading buffer混匀，电泳条件为120 V，15 min。

1.3.6 肌肉与皮下脂肪组织Western blot测定

（1）提取总蛋白方法参照RIPA裂解液说明书进行。

（2）用酶标板法测定蛋白浓度，操作参照 BCA蛋白定量试剂说明书进行。

（3）制胶槽灌入分离胶，无水乙醇压平胶平面，待分离胶凝固后加入浓缩胶。凝固后每孔加40 mg蛋白，电压80 V，待蛋白跑过浓缩胶将电压调成120 V，直到溴酚蓝指示剂跑至分离胶底部。

（4）取电泳分离条带，参照蛋白Marker切下目的基因和内参条带。按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序，每层之间不能有气泡。确保正负极连接正确，电压120 V开始转膜。

（5）将PVDF膜放入5%脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭后PVDF膜用TBST缓冲液浸洗3次，每次5 min，分别加入第一抗体（均按1﹕1 000稀释）置于脱色摇床4℃孵育过夜。次日取出PVDF膜用TBST缓冲液浸洗5次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体（均按1﹕1 000稀释），置于脱色摇床室温孵育2 h。

（6）按照ECL显色液说明书配制显色液，避光显色 1 min，用化学发光凝胶系统曝光后，确定最佳曝光条件、采集图像。用Image J软件处理目的条带，计算灰度值，以 Beta-actin为管家基因计算目的条带的相对表达量。

1.4 数据处理

数据用平均值±标准误（Mean±SE）表示。采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software公司，美国圣地亚哥）统计软件对两品种间进行独立样本非配对 T检验统计分析并作图。两组间不同小写字母表示P<0.05，不同大写字母表示P<0.01。

2 结果

2.1 XBC和ABC胴体性状比较

由表 3可见，XBC净肉率极显著高于 ABC（P<0.01），而背膘厚度显著低于 ABC（P<0.05）。XBC与ABC体重、胴体重、净肉重、骨重、屠宰率、肉骨比、肌间脂肪等胴体性状品种间无显著差异（P>0.05）。

2.2 XBC和ABC肉品质性状比较

由表 4可见，XBC肉色亮度 L*显著低于 ABC（P<0.05），XBC肉色泽偏暗，其余肉色a*、b*均差异不显著（P>0.05）。XBC与ABC水分、灰分、IMF、嫩度均差异不显著（P>0.05）。

2.3 XBC和ABC背最长肌及皮下脂肪组织形态比较

由表5、图1所示，XBC肌纤维直径和单根肌纤维横截面积均显著大于ABC（P<0.05），而肌纤维密度无明显差异（P>0.05）。由表6、图2所示，XBC皮下脂肪单位面积脂肪细胞个数极显著多于 ABC（P<0.01），而皮下脂肪细胞面积两品种牛之间差异不显著（P>0.05）。

表3 XBC和ABC胴体性状比较Table 3 Comparison of carcass traits between XBC and ABC

表4 XBC和ABC部分肉品质性状比较Table 4 Comparison of meat quality traits between XBC and ABC

图1 XBC与ABC背最长肌断面，H.E染色（10×20）Fig. 1 Slice of longissimus dorsi in XBC and ABC, H.E stain(10×20)

2.4 XBC和ABC背最长肌和皮下脂肪组织中脂代谢相关基因的mRNA表达

由图3可知，XBC与ABC背最长肌和皮下脂肪5个基因mRNA表达量差异不显著（P>0.05）。

图2 XBC与ABC皮下脂肪切片，H.E染色（10×20）Fig. 2 Slice of the subcutaneous fats in XBC and ABC, H.E stain (10×20)

2.5 XBC和ABC FAS、HSL、LPL蛋白在背最长肌和皮下脂肪组织中的表达差异

如图4所示，利用Western blot检测XBC与ABC背最长肌和皮下脂肪组织中LEP、FABP4、HSL、LPL、FAS蛋白表达水平，只检测到FAS、HSL、LPL蛋白表达，与预期条带一致。由图5可知，XBC背最长肌组织中FAS的蛋白表达量极显著低于ABC（P<0.01），HSL蛋白表达量也显著低于ABC（P<0.05）；而皮下脂肪组织中只有 HSL蛋白表达量显著低于 ABC（P<0.05）。

表5 XBC和ABC背最长肌肌纤维组织学测量Table 5 Histological measurement results of longissimus dorsi in XBC and ABC

表6 XBC和ABC皮下脂肪组织细胞面积和数量比较Table 6 Comparison of the cell area and the quantity of adipose tissue between XBC and ABC

图3 两品种牛背最长肌与皮下脂肪中LEP、HSL、LPL、FAS、FABP4基因mRNA相对表达量Fig. 3 The mRNA expression levels of LEP, HSL, LPL, FAS and FABP4 gene in longissimus dorsi and subcutaneous fat between XBC and ABC

图4 Western blot检测FAS、HSL、LPL蛋白的表达水平Fig. 4 The expression level of FAS, HSL and LPL proteins detected by Western blot

3 讨论

3.1 XBC和ABC胴体性状比较

胴体性状是评价肉牛产肉性能的重要指标。张明[21]比较了安西杂牛（黑安格斯牛×西门塔尔牛）与西门塔尔牛净肉率和背膘厚度，结果显示安西杂牛的净肉率和背膘厚度显著高于西门塔尔牛，并且表明安西杂牛产肉性能较好。本研究发现 XBC净肉率极显著高于 ABC，而背膘厚度显著低于 ABC。说明不同品种牛之间胴体性状确实存在差异，XBC产肉性能较好。

图5 XBC和ABC背最长肌与皮下脂肪中FAS、HSL、LPL蛋白相对表达量比较Fig. 5 The differential expression level of FAS, HSL and LPL proteins in longissimus dorsi and subcutaneous fat between XBC and ABC

王国富等[22]比较了36月龄ABC、海福特牛和中国西门塔尔牛3个品种牛的胴体性状，结果显示ABC和海福特牛背膘厚度极显著高于中国西门塔尔牛，并说明 ABC和海福特牛脂肪沉积能力可能比中国西门塔尔品种牛强。本研究发现 XBC背膘厚度显著低于ABC，说明ABC的脂肪沉积能力可能较强。

3.2 XBC和ABC肉品质性状

肉品质是涉及肉品的表观、质地、风味的综合性状，主要衡量指标包括肉色、风味物质、大理石花纹、嫩度、硬度、多汁性以及pH、系水力、肌肉纤维结构等[23-25]。胡猛等[26]比较了荷斯坦公牛与西门塔尔牛、XBC及新疆土种牛的肉色，结果显示荷斯坦奶公牛的肉色 L*显著高于西门塔尔牛、XBC和新疆土种牛。闫向民等[27]比较了不同月龄 XBC的肉色，发现高月龄组肉色L*显著小于低月龄组，且高月龄组肉色优于低月龄组。本研究发现 XBC肉色指标 L*显著低于ABC，说明XBC肉色优于ABC。

肌纤维特性影响肉的嫩度，肌纤维直径越小，纤维密度越大，则肉的嫩度越好。曹芝等[28]研究了草原红牛及夏洛莱牛、西门塔尔牛、红安格斯牛的高代杂种牛背最长肌纤维组织学结构的差异及与嫩度的关系，结果显示红安格斯杂交牛的肌纤维直径最小，肌节长度最长，说明其嫩度最好。本研究结果显示XBC肌纤维直径和单根肌纤维横截面积均显著大于ABC，提示与XBC相比，ABC嫩度较好。

脂肪组织的形成和在不同部位的沉积直接影响肉品质和产肉性能，细胞大小与大理石花纹密切相关[29]。ALBRECHT等[30]研究表明11月龄以后牛的脂肪细胞数量相对稳定，脂肪细胞的沉积主要是由于脂肪细胞体积的增大。本结果显示XBC与ABC皮下脂肪组织细胞面积无显著差异，可 XBC皮下脂肪组织中单位面积脂肪细胞个数极显著多于ABC，提示XBC脂肪组织细腻程度高于ABC，这可能与XBC背膘厚度显著低于ABC有关。

3.3 XBC和ABC 5种脂肪代谢调控相关基因及其产物的表达

大量研究表明，LEP可以促进甘油三酯转化，抑制脂肪酸从头合成、刺激脂肪酸氧化来抑制脂质在脂肪细胞中积累，因此LEP与肌内脂肪的沉积有关。BONNET等[10]比较了 ABC、利木赞牛、日本和牛与安格斯杂交牛3个品种肌内脂肪LEP基因mRNA表达水平，结果表明3个品种皮下脂肪组织中LEP基因mRNA表达差异不显著。而FABP4也是影响牛肉和肌内脂肪含量的候选基因之一[31]。魏胜娟等[32]研究FABP4对牛脂肪细胞分化影响时发现FABP4正向调控脂质代谢。ALBRECHT等[30]连续检测了10—22月龄日本和牛与荷斯坦牛皮下脂肪组织中FABP4mRNA表达水平，结果表明这一阶段这两个品种牛皮下脂肪组织中FABP4表达没有变化。FAS作为甘油三酯合成过程的关键酶，FAS基因表达水平的高低对肌内脂肪的沉积会产生一定的影响。曲桂娟等[33]比较了3种杂交牛背最长肌FASmRNA表达量，发现在3个品种间FASmRNA表达差异不显著。本试验测定结果显示 XBC与 ABC皮下脂肪与背最长肌中LEPmRNA、FABP4mRNA和FASmRNA表达均无品种间显著差异，这可能与本试验测定的XBC和ABC肌内脂肪含量无显著差异有关。但戢爽[34]在比较延边黄牛和延黄牛FASmRNA表达中发现延黄牛显著高于延边黄牛的结果与前述研究者和笔者的结果不一致，可能是因为品种差异所致。

脂肪沉积是一个合成与分解动态平衡过程，HSL基因和 LPL基因在脂肪分解过程起关键作用。REN等[35]报道在荷斯坦与夏洛来牛网膜脂肪和皮下脂肪组织中LPLmRNA表达差异不显著，但未研究肌肉中的LPLmRNA表达。本结果表明XBC与ABC皮下脂肪中LPLmRNA表达差异不显著，与上述结果相似。

3.4 XBC和ABC 5种脂肪代谢调控相关蛋白表达

赵称赫[36]研究表明蒙古牛肌内 FAS的活性相对较强。其实验结果表明蒙古牛背最长肌FAS表达量显著高于西门塔尔，FAS表达量与肌内脂肪含量存在正相关。本结果与上述研究结果一致。本试验发现XBC背最长肌组织中FAS蛋白表达量极显著低于ABC，可能与XBC背膘厚度显著低于ABC有关，其相关性有待进一步研究。

HSL是动物脂肪代谢过程中的关键酶。有研究表明HSL与肌内脂肪含量存在正相关，并且会促进肌内脂肪的沉积[37]。本结果表明XBC皮下脂肪组织中HSL蛋白表达量显著低于ABC，背最长肌组织中HSL蛋白表达量显著低于安格斯牛，说明 ABC脂肪沉积能力高于XBC。

LPL在脂蛋白的运输过程和能量代谢方面发挥着重要作用。BONNET等[10]报道利木赞牛皮下脂肪中LPL表达水平显著高于安格斯，指出LPL表达可能存在种间差异性。王刚等[38]也验证猪肌肉组织中LPL表达与肌内脂肪含量显著正相关，且品种不同其LPL与肌内脂肪含量相关程度不同。本结果表明XBC与ABC LPL在皮下脂肪和背最长肌表达差异不显著。

FAS和 HSL分别为胴体脂肪合成代谢与分解代谢过程中的限速酶。在本试验中 ABC在皮下脂肪和背最长肌中FAS、HSL蛋白表达均显著高于XBC。说明ABC脂肪沉积能力强。

4 结论

本研究比较发现新疆褐牛产肉性能较好；但纯种安格斯牛肉色较亮，且嫩度较好。纯种安格斯牛脂肪沉积能力强。两品种间脂代谢相关基因产物、脂肪酸合成酶和激素敏感酯酶蛋白差异可能与纯种安格斯牛背膘厚度差异有关。