程玉豆，张亚光，关军锋，冯云霄，何近刚

（河北省农林科学院遗传生理研究所/河北省植物转基因中心，石家庄 050051）

0 引言

【研究意义】近年来，西洋梨在我国市场上日益受到欢迎，其中，‘早红考密斯’梨为代表性品种。它原产于英国，属于早熟品种，果实呈葫芦状，果皮呈紫红色，果面平滑有光泽，果肉白色，具有肉质细腻、柔软多汁、风味香甜的特点，果实品质上乘[1]。但因其果实采后易软化和腐烂，货架期较短，无法满足广大消费者的需求，因此，常需要冷藏来延长供应时间。果实受采后处理、周转与运输等因素的影响，常常会导致果实品质劣变，降低商品价值，损耗严重[2]。因此，探究‘早红考密斯’梨采后冷藏和货架期品质变化规律及其相关调控机理，对果实采后贮藏保鲜新技术的研发具有重要指导意义。【前人研究进展】研究表明，在一些苹果和西洋梨品种上，适当推迟冷藏能减少果实冷害，改善品质[3-5]，但在部分白梨、猕猴桃和李子等水果中，延迟冷藏则会加重组织褐变[6-8]。1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP），可以与乙烯竞争结合受体，从而抑制乙烯介导的果实后熟相关生理生化反应。因此，1-MCP作为一种新型保鲜剂，在果蔬贮藏保鲜领域得到了广泛应用[9-10]，如 1-MCP处理可有效抑制常温货架期间果肉软化、腐烂，维持果实品质[11-13]；1-MCP可减少果实冷藏及后续货架期间虎皮病、黑心病的发生[14-17]。综上所述，1-MCP在延长果实贮藏和货架期中的作用及其机制值得重视。软化是引起果实衰老的重要因素，已有研究表明，果实软化与多聚半乳糖醛酸酶（PG）、α-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-ARF）和β-半乳糖苷酶（β-GAL）等细胞壁水解酶活性及其编码基因表达量上调密切相关[18-23]。进一步研究发现，1-MCP处理可以有效降低果实PG、α-ARF和β-GAL等酶活性及其编码基因表达，进而延缓果实软化[22-23]。【本研究切入点】尽管延迟冷藏和1-MCP处理在多种果实贮藏中得到研究，但不同品种间的效果存在差异[3-8]，并且，在‘早红考密斯’梨上，延迟冷藏的效果如何，目前还不清楚，有关1-MCP保鲜效果及其具体调控机制也缺乏系统研究。【拟解决的关键问题】通过研究1-MCP和延迟冷藏处理对‘早红考密斯’梨货架期间品质和软化的影响，解析‘早红考密斯’梨中果实软化相关基因表达模式，为延长‘早红考密斯’梨贮藏及货架期提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试‘早红考密斯’梨（Pyrus communisL. cv.‘Doyenne du Comice’）于2018年7月22日采收自河北省深州市唐奉镇东蒲疃村果园（北纬 N 38°08′15.03″，东经 E 115°34′31.34″），采收当天运回实验室。选取大小适中、成熟度相对一致、无机械损伤和病虫害的果实并平均分成2组。室温（20±2）℃下，一组进行1-MCP（有效成分0.14%，美国陶氏公司生产）密封熏蒸处理24 h（最终浓度为1.0 μL·L-1）；另一组以空气密封24 h作为对照，每组处理360个果实。结束后取出2组果实，再分别进行如下处理：（1）直接进行（0±0.5）℃冷藏；（2）（20±2）℃下放置3 d后再进行（0±0.5）℃冷藏（记作20℃ 3 d）；（3）（20±2）℃下放置6 d后再进行（0±0.5）℃冷藏（记作20℃ 6 d）。空气密封和1-MCP熏蒸处理后直接进行（0±0.5）℃冷藏果实分别记做：CK和1-MCP；处理后20℃下放置3 d后再进行0℃冷藏果实分别记做：20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 3 d；（20±2）℃下放置6 d后再进行（0±0.5）℃冷藏果实分别记做：20℃ 6 d和1-MCP+20℃ 6 d，每个处理设置3个重复，每个重复40个果实。以直接进行（0±0.5）℃冷藏计，果实贮藏95 d后取出，置于（20±2）℃下货架贮存，分别测定其0、3和6 d品质指标（硬度、可溶性固形物、可滴定酸含量）。同时，取果肉样品经液氮冷冻后于-80℃冻存，备用。

1.2 品质与腐烂率测定

硬度：将果实去皮后，采用GY-4型果实硬度计（浙江托普云农科技股份有限公司）测定。可溶性固形物含量（SSC）：采用PAL-1型手持数字糖度计（日本ATGAO公司）测定。可滴定酸（TA）含量：采用酸碱滴定法测定。每个处理重复3次，每次重复5个果实。腐烂率：统计腐烂的果实数，腐烂率计算公式如下：腐烂率（%）=（腐烂果数/总果数）×100。

1.3 呼吸速率和乙烯释放速率测定

将果实放在气密性良好的真空干燥器中密封 3 h后，采用HWF-1 CO2红外分析仪（江苏金坛市科析仪器有限公司）测定 CO2含量，计算呼吸速率。采用GC9790ⅡB型气相色谱仪（浙江福立分析仪器股份有限公司）测定乙烯含量，计算乙烯释放速率。色谱条件：载气为氮气，进样量1 mL。测定条件为：柱箱温度90℃，汽化室温度140℃，FID温度200℃；氮气流量 30 mL·min-1，氢气流量 30 mL·min-1，空气流量300 mL·min-1。每个处理重复3次，每次重复10个果实。

1.4 RNA提取与定量分析

RNA提取采用改良 CTAB法[24]；反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）和荧光定量试剂盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）均购自宝生物工程（大连）有限公司。定量分析采用ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司），反应体系：10.0 µL SYBR Green PCR Premix Ex Taq™，0.5 µL ROX Reference DyeⅡ，正、反向引物（10 µmol·L）各 0.5 µL，5 ng cDNA 模板，6.0 µL ddH2O。反应条件：95℃预变性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。反应结束后做熔解曲线确定目的基因片段的特异性。以ACT2为内参基因，采用2-ΔCT法计算目标基因表达量，PG1、PG2、ARF1、ARF2和GAL4定量分析引物参考WEI等[22]文献报道，具体如表1所示。

表1 果实软化相关基因qRT-PCR引物Table 1 Primers of the fruit softening-related gene for qRT-PCR

1.5 数据分析和处理

数据采用Excel 2007和SPSS 18.0软件进行作图和统计分析，方差分析采用Duncan法，结果用3次重复的平均值表示。

2 结果

2.1 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨冷藏后腐烂的影响

由表2可知，出库当天（货架0 d）时，空气密封处理后再延迟3 d（20℃ 3 d）和6 d（20℃ 6 d）冷藏的果实明显加剧腐烂，分别是空气密闭处理后（0±0.5）℃直接冷藏果实（CK）的3.8和10.4倍，说明在不进行 1-MCP处理时，延迟冷藏明显不利于果实贮藏保鲜；相反，1-MCP处理可明显降低‘早红考密斯’梨出库时腐烂率，尽管1-MCP处理果实在延迟冷藏后也加剧果实腐烂，但与20℃ 3 d和20℃ 6 d处理相比，果实腐烂明显减少，在生产上具有实际意义。总体来说，保鲜效果最好的是 1-MCP处理后再（0±0.5）℃直接冷藏处理（1-MCP）果实。20℃ 3 d和20℃ 6 d处理果实由于腐烂严重，无法再进行后续研究。其他处理在货架6 d内均未出现腐烂，可用于后续研究。

2.2 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期品质的影响

随着货架期延长，各处理间果实硬度均呈下降趋势，并且延迟冷藏会加速果实软化；与CK相比，‘早红考密斯’梨经1-MCP处理后，果实具有较高的硬度，直接冷藏处理的果实硬度最高，1-MCP处理后延迟6 d冷藏（1-MCP+20℃ 6 d）果实硬度下降程度最大，1-MCP处理后延迟3 d冷藏（1-MCP+20℃ 3 d）果实硬度介于二者之间（图1-A）。SSC在处理与对照果实间差异较小，除货架3 d时，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d处理果实SSC显著高于CK外，其他货架时间各处理则无显著差异（图1-B）；TA含量在各处理果实中均呈缓慢下降趋势，其中，1-MCP处理果实在货架3 d时显著高于CK，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d处理果实在货架6 d时显著高于CK（图 1-C）。说明 1-MCP能明显延缓‘早红考密斯’梨果肉的软化速度，1-MCP结合延迟冷藏后有一定的促进软化作用，并能保持较好的风味。

2.3 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨冷藏后货架期呼吸速率和乙烯生成速率的影响

‘早红考密斯’梨在冷藏后货架0 d时，1-MCP结合延迟冷藏处理果实呼吸速率显著低于CK；随着货架期延长，CK果实呼吸速率迅速上升，1-MCP结合延迟冷藏处理果实呼吸速率上升则较缓慢。在货架6 d时，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d处理果实呼吸速率有所下降（图2-A）。货架0 d时，CK果实的乙烯释放速率最高，随着货架时间延长，乙烯释放速率大幅降低；与CK相比，1-MCP结合延迟冷藏处理果实乙烯释放速率变化不明显，在货架0 d和3 d时低于对照，但在6 d时与对照接近（图2-B）。

表2 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨果实腐烂的影响Table 2 Effect of 1-MCP and delayed cold-storage on the decay of 'Doyenne du Comice' pear fruit

图1 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期硬度（A）、可溶性固形物（B）和可滴定酸含量（C）的影响Fig. 1 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the firmness (A), SSC (B) and TA content (C) of 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.4 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨冷藏后货架期PGs表达的影响

图2 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期呼吸速率（A）和乙烯释放速率（B）的影响Fig. 2 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the rates of respiration (A) and ethylene production (B) of'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

实时荧光定量PCR分析结果显示，CK果实中，PG1表达呈先上升后下降趋势，在货架期3 d时表达量最高；而1-MCP结合延迟冷藏处理果实中PG1表达量则呈持续增加趋势，但在货架期0 d和3 d时，PG1表达量显著低于CK；货架6 d时，1-MCP+20℃ 3 d和 1-MCP+20℃ 6 d处理果实中PG1表达量高于CK，并以1-MCP+20℃ 6 d处理的PG1表达量最高（图3-A）。与PG1相似，CK果实中，PG2表达模式也呈先上升后下降趋势。1-MCP结合延迟冷藏处理果实在货架期0 d时，PG2表达量显著低于CK，然后逐渐升高；货架3 d时，1-MCP+20℃ 6 d处理果实中PG2表达量开始显著高于CK；货架6 d时，1-MCP结合延迟冷藏处理果实中PG2表达量均显著高于CK，并表现为1-MCP+20℃ 3 d处理的最高，1-MCP+ 20℃ 6 d处理的次之，1-MCP处理最低（图3-B）。

图3 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期PGs表达的影响Fig. 3 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of PGs in the 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.5 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨冷藏后货架期ARFs表达的影响

ARF1在 CK果实中同样呈现先缓慢上升再下降的趋势，并且，1-MCP结合延迟冷藏处理果实中ARF1表达量在整个货架期均显著低于CK；在货架3 d时，1-MCP+20℃ 6 d处理果实ARF1表达量显著高于1-MCP和1-MCP+20℃3 d处理果实，而在货架6 d时，1-MCP+20℃ 3 d处理果实ARF1表达量则显著高于1-MCP和1-MCP+20℃ 6 d处理果实（图4-A）。与ARF1表达模式不同，ARF2在所有处理中均表现出随着货架时间延长而表达量逐渐下降的趋势，与CK相比，1-MCP结合延迟冷藏处理显著抑制了货架期间ARF2表达；并且，在货架0 d和3 d时，1-MCP处理果实ARF2表达量均为最低（图4-B）。

图4 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期ARFs表达的影响Fig. 4 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of ARFs (A and B) in the 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.6 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨冷藏后货架期GAL4表达的影响

在1-MCP结合延迟冷藏处理的果实中，GAL4表达量在货架期间均显著低于CK果实，并且货架0 d和3 d时，GAL4表达量表现为1-MCP+20℃ 6 d处理的最高，1-MCP+20℃ 3 d处理的次之，1-MCP处理最低；而在货架6 d时，1-MCP+20℃ 6 d处理果实的GAL4表达量则显著高于1-MCP和1-MCP+20℃ 3 d处理的果实（图5）。

3 讨论

图5 1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期 GAL4基因表达的影响Fig. 5 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of GAL4 in the 'Doyenne du Comice'pear during shelf-life

乙烯在调控呼吸跃变型果实成熟衰老过程中发挥着重要的作用[25]。本研究中，1-MCP处理可显著抑制‘早红考密斯’梨果实冷藏后货架期呼吸速率和乙烯释放速率，这与其抑制梨果实乙烯合成酶活性及相关基因表达有直接关系[26-27]，表明 1-MCP可通过降低‘早红考密斯’梨内源乙烯合成延缓果实成熟衰老。西洋梨果肉软化是其成熟衰老的重要指标之一。研究表明，一些西洋梨品种如‘巴梨’‘安久’‘阿巴特’和‘康复伦斯’梨等使用1-MCP处理后，贮藏和货架期果肉软化减缓，果实腐烂和虎皮病减少[27-31]。与上述研究结果相似，本研究中，1-MCP处理也可有效延迟果实冷藏后货架期硬度下降，减少果实腐烂，因此，1-MCP处理有利于‘早红考密斯’梨采后贮藏保鲜。本研究还发现，随着延迟冷藏时间延长，‘早红考密斯’梨果实腐烂率明显加剧，但经1-MCP处理可明显减少腐烂，与此同时，1-MCP结合延迟冷藏处理的果实在货架期硬度下降速度相对较快，因此，从西洋梨自身品种特性——需后熟软化的意义上来讲，对于1-MCP处理过的果实，可适当延长常温下运输或周转时间。如果单纯为了减少腐烂，在‘早红考密斯’梨采后贮藏中，无论是否使用1-MCP处理，果实采收后应尽快入冷库贮藏。

果实软化过程主要由细胞壁结构破坏及果胶物质降解引起，其中以PG研究最为深入。研究表明，PG参与了梨果实采后软化过程[22-23,32]。在‘南果’梨中，PuPG1、PuPG4和PuPG7在采收后的果实中开始表达，且随着贮藏时间的延长，表达量逐渐升高，1-MCP处理明显抑制3个基因的表达[33]。‘京白’梨中，PG1和PG2随着硬度下降表达量迅速升高，1-MCP处理在显著抑制果实乙烯生成和硬度下降的同时，极显著抑制了PG1和PG2表达量升高[18]。本研究结果与‘南果’和‘京白’梨中的报道相似，即货架期果实软化越快，PG1和PG2表达量在软化前期就越高，反之亦然，这说明PG1和PG2因参与了‘早红考密斯’冷藏后货架期果实软化过程。相比于PG1，各处理果实中PG2在货架期0 d时稍低，但在后续货架期变化幅度较PG1大，推测PG1和PG2在‘早红考密斯’梨冷藏后货架期果实软化过程的作用可能略有不同，PG1可能在果实软化前期起主要作用，而PG2则可能在果实软化中期起主要作用。

α-ARF和β-GAL与果实成熟时细胞壁的修饰过程密切相关，α-ARF可以通过水解果胶上的阿拉伯糖苷键而引起细胞壁完整性遭到破坏；而β-GAL则通过降解果胶多聚醛酸链上的半乳糖苷键使细胞壁变得膨胀而不稳定，这两种酶活性及其基因表达量升高均可导致果实软化[21,34-35]。本研究中，ARF1表达量高，果实硬度下降迅速，并且1-MCP处理抑制了ARF1的表达，硬度下降缓慢，这与‘京白’梨常温贮藏中的研究结果相似[22]，表明ARF1参与了‘早红考密斯’梨货架期果实软化过程，1-MCP通过抑制其表达延迟果实软化进程，达到果实保鲜效果。ARF2由于在各处理中随着货架期延长表现出表达量逐渐下降，与果实硬度下降的趋势不同，因此，推测其可能不参与‘早红考密斯’梨货架期软化过程。已有研究证实，西洋梨中GAL1/2在果实软化前期表达量迅速升高，并受1-MCP处理抑制[21]；在日本梨中，JP-GAL只在成熟果实中表达，并且与果实软化密切相关[35]；‘京白’梨采后货架期间GAL4表达量伴随着果实硬度下降而逐渐升高，1-MCP处理可以显著抑制其表达和硬度下降[22-23]。本研究发现，GAL4表达模式也与果实软化密切相关，即在果实硬度下较降快的处理中，GAL4表达量高；果实硬度下降缓慢的处理中，GAL4表达量相对较低，结合日本梨和‘京白’梨的研究结果，说明GAL4参与了‘早红考密斯’梨果实货架期软化过程，1-MCP可以通过抑制GAL4表达延迟果实货架期软化进程。

4 结论

‘早红考密斯’梨延迟冷藏易导致果实贮藏期软化速度加快，果实腐烂严重，建议采收后尽快入库冷藏。1-MCP处理能够有效延迟‘早红考密斯’梨货架期果实硬度下降，抑制果实呼吸和内源乙烯生成，减少果实腐烂，保持果实品质，起到了很好的保鲜作用。与1-MCP处理后直接冷藏相比，1-MCP结合延迟冷藏6 d处理可一定程度促进货架期果实软化。1-MCP通过抑制软化相关基因PG1、PG2、ARF1和GAL4等的表达，维持‘早红考密斯’梨货架期果实硬度，达到保鲜效果。