刘晓飞 侯 艳 马京求 关桦楠 张 娜 马永强

(哈尔滨商业大学食品工程学院， 哈尔滨 150076)

0 引言

全球玉米的年产量超过10.3亿t，其中近50%由玉米芯、秸秆等组成[1]。玉米芯是玉米生产过程中产生的具有高木糖含量的能量密集型农业废弃物[2]，也是一种木质纤维素材料，其成分主要有纤维素、半纤维素和木质素[3]。玉米芯能量密度比常见的生物质(如玉米秸秆和柳枝稷)高出近两倍。与玉米秸秆和柳枝稷相比，玉米芯中木质素含量较低，是开发生物转化技术产品的适宜原料[4]，可作为一种可再生生物质生产可溶性糖，还可以通过化学、微生物降解等发酵方法生产液体生物燃料，如乙醇等[5-7]。文献[8]以O2为氧化剂，在水溶液中将玉米芯转化为甲酸和乙酸。文献[9]以硫酸为催化剂，通过水解玉米芯生产乙酰丙酸。

由于玉米芯中木质纤维素生物质的复杂性和顽固性，在温和条件下将其转化为有价值、高收率、高选择性的化工产品还面临诸多挑战，尤其是在前期预处理阶段[10-11]。文献[12]通过研发3种不同的微波辅助碱盐预处理方法来提高玉米芯废料的糖产量，这些预处理方法可有效提高木质纤维素糖的回收效率，可用于可溶性糖、微生物燃料的生产。文献[13]研发了一种利用表面活性剂(吐温80)同时进行玉米芯预处理和糖化来提高生物乙醇产量的方法，结果表明，添加10%的吐温80进行预处理和糖化，得到的葡萄糖和木糖产量最大，乙醇产量也有所提高。近年来研究发现，许多微生物具有纤维素降解能力，并且可应用于玉米芯的降解。文献[14]构建了一株具有天然木糖醇积累能力的产木糖醇工业酵母菌株PE-2，用来降解玉米芯、生产木糖醇。文献[15]利用经生物整合处理的纤维素水解梭状芽胞杆菌发酵玉米芯，生产正丁醇。

放线菌通过提高纤维素的水溶性、增强菌丝穿透性从而降解纤维素，且在高温及高碱等极端环境下对木质素仍具有显著的降解作用。本文从东北寒地黑土中筛选得到一株具有高效降解纤维素的放线菌GS-3-39，将其作为玉米芯工业生产的预处理剂，以提高玉米芯木质纤维素降解率，从而提高其利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1样品来源

土壤样品来自黑龙江省牡丹江市(43°24′N，128°2′E)，玉米芯产自黑龙江省哈尔滨市。

1.1.2仪器与设备

LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器(济南鑫贝西生物技术有限公司)；DHG-9123A型电热恒温培养箱(深圳市中盛科仪科技有限公司)；ZHJH-C1115B型超净工作台(上海双旭有限公司)；TG16-WS型台式高速离心机(山东博科科学仪器有限公司)；PerkinElmer UATR Two型红外光谱仪(珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)；S-3400NⅡ型扫描电镜(苏州佐藤精密仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1培养基制备

GS固体培养基：可溶性淀粉6 g，KNO30.3 g，NaCl 0.15 g，K2HPO4·3H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，FeSO4·7H2O 0.003 g，琼脂5.4 g，pH值7.2～7.4。

燕麦汁琼脂(ISP3)固体培养基：燕麦片20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.8 g，NaCl 0.8 g，琼脂粉20.0 g，pH值7.2～7.4。

GY液体培养基：酵母浸粉1 g，葡萄糖1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，pH值7.2～7.4。

发酵培养基：玉米秸秆2 g，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，pH值7.2～7.4。

CMC培养基：CMC(羧甲基纤维素钠)1.5%，酵母膏0.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.05%，pH值7.2～7.4。

1.2.2菌种的分离、纯化

土样经自然风干，研磨后取5 g与45 mL无菌水混合，加适量玻璃珠于28℃、180 r/min振荡30 min，过滤后得到质量分数10%原液，原液依次稀释至质量分数0.1%、0.01%、0.001%，分别取200 μL于培养基上进行涂布，于28℃条件下倒置培养15 d，然后将培养基上长出的放线菌挑入ISP3培养基进行单一菌的筛选。

1.2.3刚果红染色试验

将筛选出的菌种接入CMC培养基中培养15 d，进行刚果红染色试验，进行纤维素降解能力的测定。

1.2.4菌种鉴定

形态学鉴定：将菌株接入ISP3固体培养基上，28℃下恒温培养3～4 d后，观察菌落大小、颜色、边缘状况；将菌株接入GY液体培养基中，28℃、180 r/min恒温振荡条件下培养3～4 d，取适量菌液于载玻片上，固定后用番红染色，观察菌丝形态。

分子生物学鉴定：参照文献[16]并加以修改进行16S rRNA分子生物学鉴定。将获得的单菌株进行DNA提取，连接T载体，热转化后挑取阳性克隆，进行PCR扩增；送到检测机构测序，构建该菌株的系统发育树。

1.2.5单因素试验

以玉米芯木质纤维素降解率为指标，研究发酵时间(1、3、5、7、9 d)、培养基初始pH值(4、5、6、7、8)、发酵转速(120、140、160、180、200 r/min)、发酵温度(24、26、28、30、32℃)及接菌量(玉米芯发酵培养基中菌质量分数为1%、2%、3%、4%、5%)对玉米芯木质纤维素降解率的影响，按照上述单因素依次进行试验并测定玉米芯木质纤维素降解率，且后续单因素试验均在前一因素试验的较优结果上进行。

1.2.6玉米芯木质纤维素降解率测定

玉米芯洗净、干燥，利用万能粉碎机粉碎后，过40目筛，备用。将配制好的菌悬液接种到玉米芯发酵培养基中，按单因素试验条件进行发酵培养，发酵结束后，降解后的玉米芯用质量恒定后的质量为m0的滤纸进行过滤，经水冲洗后，经中性洗涤剂(3%十二烷基硫酸钠)煮沸处理，除去可溶性物质，置于105℃干燥1 h，干燥冷却器中静置30 min后称量，质量记为m1，再105℃干燥1 h，干燥冷却器中静置30 min后称量，质量记为m2(m1与m2相差不高于0.02 g即为质量恒定)，质量恒定后的质量减滤纸的质量m0即为降解剩余物质量m3。玉米芯木质纤维素降解率Y计算公式为

Y=(m-m3)/m×100%

(1)

式中m——培养基中玉米芯粉末质量，g

1.2.7发酵条件响应曲面法优化

利用Design-Expert 8.0软件对发酵条件进行优化[17]。确定玉米芯木质纤维素降解率最优发酵条件。

1.2.8玉米芯中主要成分的测定

采用范氏洗涤法[18]测定降解前、后玉米芯中纤维素、半纤维素、木质素和灰分的含量。

1.2.9扫描电镜观察

参照文献[19]处理玉米芯，在响应曲面法确定的最优条件下发酵玉米芯，对玉米芯降解前后进行扫描电镜观察。

1.2.10红外光谱观察

参照文献[20]处理玉米芯，在响应曲面法确定的最优条件下发酵玉米芯，对玉米芯降解前后进行红外光谱观察。

2 结果与分析

2.1 菌株GS-3-39刚果红染色结果

筛选出一株纤维素降解能力较强的放线菌，命名为GS-3-39，其刚果红染色结果如图1所示。

图1 菌株GS-3-39刚果红染色结果Fig.1 Strain GS-3-39 Congo red staining results

由图1得到透明圈与菌落直径比值最大的菌株，该菌株刚果红染色后透明圈的直径D为(22.63±2.36) mm，菌落生长的直径为(4.93±0.74) mm，其透明圈与菌落直径比值为4.62±0.26，说明GS-3-39具有较好的纤维素降解能力。

2.2 菌种鉴定结果

2.2.1形态学鉴定结果

菌株形态学鉴定如图2、3所示。

图2 单菌落形态Fig.2 Morphology of single colony

图3 番红染色镜检图Fig.3 Gram staining microscopy

由图2可知该菌株在ISP3固体培养基上的生长形态，菌体呈黄色且周围产生黄色孢子，图3为番红染色结果，该菌可产生均匀菌丝，可初步鉴定该菌为放线菌属。

2.2.2分子生物学鉴定结果

(1)菌株的PCR扩增结果

图4 菌株GS-3-39的PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of strain GS-3-39

菌株的PCR扩增结果如图4(图中Marker为DL2000 DNA Marker，1、2均为菌株GS-3-39的PCR扩增结果)所示。图4中1 500 bp左右有一个明亮且清晰的条带。

(2)菌株的质粒提取结果

质粒提取结果如图5(图中Marker为DL5000 DNA Marker，1、2均为菌株GS-3-39的质粒提取结果)所示。由图5可知，质粒条带清晰，外送测序。

(3)系统发育树的构建

系统发育树的构建结果如图6所示。由图6可确定菌株GS-3-39为放线菌属。

图5 菌株GS-3-39的质粒提取结果Fig.5 Plasmid extraction results of strain GS-3-39

图6 菌株系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strains

2.3 单因素试验结果分析

2.3.1发酵时间

发酵时间对玉米芯木质纤维素降解率的影响结果如图7所示。

图7 不同发酵时间时的玉米芯木质纤维素降解率变化曲线Fig.7 Effect of fermentation time on cellulose degradation rate of corn cob

由图7可知，玉米芯木质纤维素降解率随发酵时间的延长而增大，在发酵5 d时降解率达到16.95%。原因可能是放线菌GS-3-39繁殖数量增多，产酶量增多，降解率增大。后随着时间的增长降解率虽有提高但并不显著，考虑到成本问题，将最佳发酵时间定为5 d。

2.3.2培养基初始pH值

培养基初始pH值对玉米芯木质纤维素降解率的影响结果如图8所示。

图8 不同培养基初始pH值时的玉米芯木质纤维素降解率变化曲线Fig.8 Effect of initial pH value of medium on cellulose degradation rate of corn cob

由图8可知，在培养基初始pH值为5时达到木质纤维素降解率的最高值18.355%。原因可能是放线菌GS-3-39生长最适pH值为5。

2.3.3发酵转速

发酵转速对玉米芯木质纤维素降解率的影响结果如图9所示。

图9 发酵转速对玉米芯木质纤维素降解率的影响Fig.9 Effect of fermentation revolution on cellulose degradation rate of corn cob

由图9可知，在转速为160 r/min时达到最高降解率19.485%。原因可能是随着发酵转速的增大，放线菌GS-3-39产的木质纤维素酶与玉米芯充分接触，使木质纤维素的降解率逐渐增大，当转速再增大时，致使菌细胞壁破裂，菌种死亡，降解率下降。

2.3.4发酵温度

发酵温度对玉米芯木质纤维素降解率的影响结果如图10所示。

图10 发酵温度对玉米芯木质纤维素降解率的影响Fig.10 Effect of fermentation temperature on cellulose degradation rate of corn cob

由图10可知，在28℃时达到降解率最高值20.57%。原因可能是此温度是放线菌GS-3-39最适生长温度，此温度下酶作用能力最强。

2.3.5接菌量

接菌量对玉米芯木质纤维素降解率的影响结果如图11所示。

图11 接菌量对玉米芯木质纤维素降解率的影响Fig.11 Effect of bacterial inoculation on cellulose degradation rate of corn cob

由图11可知，当接菌量为3%时达到最高的降解率21.335%。原因可能是接菌量逐渐增加，酶浓度增大使降解率增大，当接菌量继续增加时，菌数量过多培养基营养不足造成菌间竞争增大，菌大量死亡使降解率下降。

2.4 响应曲面法发酵条件优化结果分析

根据上述单因素试验结果可知，玉米芯木质纤维素降解率最佳发酵时间为5 d，因此选择培养基初始pH值、发酵转速、发酵温度、接菌量作为响应面优化的影响因素。确定玉米芯木质纤维素降解率最佳提取的条件为培养基初始pH值为5、发酵转速为160 r/min、发酵温度为28℃、接菌量为3%，各因素在最佳条件点左右分别选取1个试验点，进行四因素三水平的响应面试验，如表1所示。使用Design-Expert 8.0软件对表2(表中A、B、C、D分别表示培养基初始pH值、发酵转速、发酵温度、接菌量的编码值)中试验数据进行响应面回归分析，得到该试验的回归模型方程

Y=26.68+0.48A+1.36B+0.41C+0.72D-
0.28AB-0.39AC+0.13AD-0.060BC+0.45BD+
1.08CD-3.55A2-3.45B2-2.11C2-5.04D2

表1 响应面因素与编码Tab.1 Response surface factors and coding

表2 响应面试验设计与结果Tab.2 Response surface test design and results

对试验所得的数据进行方差分析和显著性检验，结果如表3所示。

表3 响应面试验结果方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface test results

由表3可以看出，玉米芯木质纤维素降解率回归方程P<0.000 1，表明玉米芯木质纤维素降解率的回归方程与全部自变量间的关系极为显著，方程极显著；而玉米芯木质纤维素降解率回归方程的失拟项P>0.05，差异性不显著，这表示上述4个因素对试验结果的干扰不明显，残差由随机误差引起，表示该回归模型与实测值能够较好地拟合。获得的响应曲面图如图12～14所示。

图12 培养基初始pH值、发酵温度对玉米芯木质纤维素降解率的等高线及响应曲面Fig.12 Contour line and response surface of initial pH value of medium and fermentation temperature on cellulose degradation rate of corn cob

图13 发酵转速、接菌量对玉米芯木质纤维素降解率的等高线及响应曲面Fig.13 Contour line and response surface of fermentation revolution and inoculation amount on cellulose degradation rate of corn cob

图14 发酵温度、接菌量对玉米芯木质纤维素降解率的等高线及响应曲面Fig.14 Contour line and response surface of fermentation temperature, inoculation amount and cellulose degradation rate of corn cob

运用Design-Expert 8.0软件，设置玉米芯木质纤维素降解率同时达到极大值时，求解得到玉米芯木质纤维素降解的理论最优条件为：培养基初始pH值为5.06、发酵温度28.22℃、发酵转速163.98 r/min、接菌量为3.09%，在此条件下的玉米芯木质纤维素降解率理论值为26.881%。在该条件下做重复试验得到降解率为27.264%，与理论值相差不大，证明该模型有效。

2.5 玉米芯主要成分的测定

玉米芯降解前后成分及其含量如表4所示。由表4可知，接种放线菌GS-3-39降解后，玉米芯中纤维素的降解率为39.84%、半纤维素的降解率为38.33%、木质素的降解率为47.38%，说明GS-3-39对纤维素、半纤维素、木质素均具有一定的降解作用。文献[21]采用连续碱挤压降解玉米芯中木质纤维素，结果表明：处理后纤维素质量分数从(42.0±0.15)%降至(37.6±1.22)%，半纤维素质量分数从(45.9±0.1)%降至(39.4±1.2)%，比较可知，GS-3-39对纤维素、半纤维素的降解效果均比该方法高。文献[22]评估不同玉米芯的预处理方法，其中碱性过氧化法效果最好，纤维素质量分数从16%增加至59%，木质素降解率约78%，半纤维素溶解高达79%，虽然木质素及半纤维素降解率较高，但增加了纤维素含量，预处理较困难，而GS-3-39对纤维素、半纤维素、木质素均有降解作用。

表4 玉米芯降解前后成分质量分数Tab.4 Components of corn cob before and after degradation %

2.6 玉米芯降解前后扫描电镜观察结果

图15 降解前玉米芯表面组织结构Fig.15 Surface structure of corn cob before degradation

图16 降解后玉米芯表面组织结构Fig.16 Surface structure of corn cob after degradation

玉米芯降解前、后表面组织结构扫描电镜结果如图15、16所示。由图15、16可得，降解前玉米芯表面结构呈紧密、平整排列，降解后结构遭到破坏，裂解且多孔，说明GS-3-39对玉米芯中的结构成分就有降解作用。

2.7 玉米芯降解前后红外光谱观察结果

图17 玉米芯降解前后红外光谱Fig.17 Infrared spectra of corn cob before and after degradation

3 讨论

玉米芯是玉米生产的副产物，是重要的木质纤维素资源，木质纤维素是自然界中最为丰富的有机物质，它的生物降解是许多需氧、兼性厌氧和专性厌氧细菌和真菌的特征[23]。木质纤维素经预处理后可以作为原料生产生物质能源。如纤维素燃料乙醇[24]，是指充分利用纤维素原料(如玉米芯)中的纤维素及半纤维素，使之经水解、糖化后，再经糖发酵过程生产的一种燃料乙醇。文献[25]以玉米芯为原料，研究了木素磺酸盐(SLQA)和十二烷基二甲基甜菜碱(BS12)对乙醇产量的影响。结果表明，SLQA和1 g/L BS12通过促进酶解，可有效提高乙醇产量。文献[26]以玉米芯为原料，研究利用农业废弃物生产木糖醇。优化预处理方法得到最佳木糖醇的产率为85%。因此找到一种有效降解玉米芯中的木质纤维素成分的方法成为当前的研究重点。本文研究放线菌GS-3-39对其的降解作用，未来可利用GS-3-39作玉米芯生产生物能源的预处理剂，或通过基因工程改造技术，使其降解木质纤维素能力更强。

4 结束语

本文筛选出一株高效降解纤维素的放线菌GS-3-39，运用Design-Expert 8.0软件，得到最优组合条件下玉米芯木质纤维素降解率的理论最优值为26.881%。在最优条件下进行重复试验得到降解率为27.264%，且GS-3-39对玉米芯中纤维素、半纤维素、木质素降解率分别为39.84%、38.33%、47.38%。